秦巴不同生態區烤煙基因表達譜分析

金保鋒，扈 強，葉為民，阮 志，李曉娜，陳富彩，勾 薇，崔志燕，4，張 玲，高 梅，張立新*

1.廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州市天河區林和西橫路186號 510385

2.西北農林科技大學生命科學學院，陜西省楊凌示范區西農路22號 712100

3.西北農林科技大學資源環境學院，陜西省楊凌示范區邰城路3號 712100

4.商洛市煙草公司鎮安縣分公司，陜西省商洛市鎮安縣宏化街17號 715000

秦巴不同生態區烤煙基因表達譜分析

金保鋒1，扈 強1，葉為民1，阮 志2，李曉娜3，陳富彩2，勾 薇2，崔志燕2，4，張 玲2，高 梅2，張立新*2

1.廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州市天河區林和西橫路186號 510385

2.西北農林科技大學生命科學學院，陜西省楊凌示范區西農路22號 712100

3.西北農林科技大學資源環境學院，陜西省楊凌示范區邰城路3號 712100

4.商洛市煙草公司鎮安縣分公司，陜西省商洛市鎮安縣宏化街17號 715000

為了揭示不同生態區烤煙風格特色形成的機理，采用Agilent煙草寡聚芯片技術，對商洛市洛南縣和寶雞市隴縣（對照）兩個生態區烤煙打頂后15 d同一品種（秦煙96）中部葉的基因表達譜進行了初步分析。結果表明：與隴縣相比，在44 000個基因中洛南煙區煙葉有2 058個基因差異表達，其中上調基因962個，占46.74%；下調基因1 096個，占53.26%。按功能富集分類，這些差異基因主要富集在代謝、響應外界刺激及生理調控等生物學過程，大部分位于胞外區與細胞內膜系統。其中洛南煙區碳水化合物合成代謝較為活躍，隴縣煙區萜類化合物代謝、苯丙烷代謝、芳香族化合物合成代謝較為活躍。基因代謝通路分析表明，細胞信號轉導、轉錄因子及參與植物非生物脅迫相關基因在兩個煙草種植區均為高表達。

烤煙；生態區；秦煙96；基因；基因芯片；表達譜

基因芯片技術可用于高通量基因表達平行分析、大規模基因發現及序列分析、基因多態性分析和基因組研究等［1］。目前，基因芯片技術已在水稻、玉米、小麥等［2-4］作物上廣泛應用，而以煙草為材料的研究報道較少。楊天旭等［5］發現滲透脅迫48 h后，煙草根系上調表達基因主要是激素響應蛋白基因、鈣信號響應蛋白基因及蛋白激酶基因，而下調表達基因則主要是赤霉素響應蛋白類基因和泛素連接酶類基因。利用基因芯片技術研究不同生態區煙草葉片基因表達情況僅有崔紅等［6］對烤煙移栽后60 d葉面腺毛表達譜進行過初步分析，而有關不同生態區烤煙打頂后煙葉基因表達譜變化的研究尚未見報道。因此，采用煙草寡聚芯片技術對兩個生態區烤煙打頂后煙葉基因表達變化進行試驗，旨在從分子水平上揭示生態因子對相同基因型烤煙物質代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年進行，分別設置在寶雞市隴縣（LX，對照）曹家灣鎮流渠村（海拔1 055 m，N 34°53'57.3"，E 106°42'46.6"）和商洛市洛南縣（LN）城關鎮樊村（海拔 920 m，N 34°01'58''，E 110°18'05"）。供試材料為烤煙品種秦煙96。2013年洛南煙區大田期（5月—9月）平均氣溫12.51～25.56℃，月降水量為29.80～45.00 mm，大田期光照時數累計值為1 183.14 h；隴縣煙區大田期平均溫度為13.00～26.37℃，月降水量為65.20～259.40 mm，大田期光照時數累計值為1 220.55 h。兩生態煙區烤煙均于5月7日移栽，7月23日打頂。按當地煙葉生產技術規范進行煙田管理。移栽后15 d選擇標記長勢長相均勻一致的煙株10株，分別在烤煙打頂后15 d（8月6日），用打孔器打下中部葉片第10葉位的葉片樣品，置于液氮速凍，帶回實驗室，置于-80℃冰箱中，保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及純化

采用Trizol（美國Gibco BRL公司）提取煙草葉片總RNA，并進一步用RNA去除試劑盒（德國MACHEREY-NAGEL公司）對總RNA進行純化。

1.2.2 cRNA的合成及熒光標記

以總RNA起始，含有T7噬菌體RNA聚合酶啟動子序列的寡聚dT為引物，使用CbcScript酶合成cDNA第一條鏈。用核糖核酸酶H（RNaseH）將雜合鏈中的RNA切成隨機短片段，DNA聚合酶以RNA短片段作為引物進行延伸，合成與cDNA第一條鏈互補配對的第二條鏈，并純化雙鏈cDNA。以cDNA為模板，利用T7酶混合物合成cRNA，然后用RNA去除試劑盒純化。取5 μg cRNA，用CbcScriptⅡ酶利用隨機引物進行反轉錄，反轉錄產物用PCR NucleoSpinExtract II Kit（德 國 MACHEREYNAGEL公司）純化。取上述反轉錄產物，以隨機引物進行Klenow酶標記，之后用PCR NucleoSpin Extract II Kit純化經Klenow酶標記的產物，純化后干燥。用熒光染料Cy5-dCTP和Cy3-dCTP（美國GE Healthcare公司，型號：No.PA 55021/PA53021）分別標記試驗樣品（一種為洛南樣品，另一種為隴縣樣品）。洛南與隴縣兩地樣品設為一組，組內試驗采用熒光正反標的方法進行標記，每個樣品進行2組4次獨立雜交試驗，每組3次生物學重復。

1.2.3 芯片的檢測與數據分析

將標記的DNA溶于2×GEx Hyb Buffer+25%甲酰胺的雜交液中，45℃條件下雜交過夜。雜交結束后，在42℃左右含0.2%SDS+2×SSC的液體中漂洗5 min，之后置于25℃下，0.2×SSC中漂洗5 min。玻片干燥后用微陣列掃描儀（G2565CA型，美國Agilent公司）對芯片進行掃描，得到雜交圖。

采用Feature Extraction圖像分析軟件將芯片圖像信號轉為數字信號。運用批Percentile shift方法，將原始數據導入至GeneSpring GX軟件中，對數字信號值進行歸一化處理。以絕對差異倍數（Absolute Fold change）大于或等于2、同時用Flag數據標簽標記成可檢測的標準形式進行差異基因篩選。絕對差異倍數越大，說明兩個樣品之間的差異越大。

1.2.4 生物信息學分析

查閱NCBI數據庫對差異表達基因進行分析。采用AgriGO和WEGO等［7］網站對差異表達基因進行GO注釋和富集分析，并運用BLASTN對基因代謝途徑進行分析。

2 結果與分析

2.1 RNA提取與芯片雜交結果

經甲醛變性膠電泳檢測，RNA樣品電泳條帶清晰，見圖1。28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近 2∶1，且 A260/A280≥1.80，RNA 總量≥8 μg（表 1），滿足了表達譜芯片實驗要求。表明RNA純度及完整性可滿足后續實驗要求。

圖1RNA電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of RNA

表1 樣品質檢結果Tab.1 Quality of samples

烤煙打頂后15 d，在44 000個芯片探針中，檢測到的雜交信號有34 080個，檢出率為77.45%。說明在兩個煙區樣品中共檢測到34 080個基因的表達量發生了變化。將兩組實驗的熒光數據校正、整合后制作散點圖，見圖2。從圖2可以看出，多數數據點集中在上下兩條斜線之間，說明絕大多數基因在兩個生態區中表達差異不大。

2.2 烤煙基因表達差異分析

圖3顯示，與隴縣相比，洛南煙區煙葉表達量差異在2倍以上的有2 058個，其中上調基因有962個，占46.74%；下調基因有1 096個，占53.26%。

2.3 烤煙差異表達基因富集分析

應用AgriGO和WEGO數據庫進行基因本體注釋和功能富集分析。圖4顯示，烤煙打頂后15 d，與隴縣相比，在洛南煙區烤煙葉片2 058個差異表達基因中有763個（37.07%）基因有功能注釋。差異表達基因顯著富集在代謝、響應刺激及生理調控等生物學過程中，定位在細胞膜、胞內及細胞器中。同時這些差異表達基因翻譯的蛋白質主要具有催化活性、分子轉運及轉錄調控活性。

圖2 洛南煙區烤煙煙葉差異表達基因散點圖Fig.2 Differentially expressed gene scatterplot of flue-cured tobacco leaves from Luonan

圖3 洛南煙區烤煙煙葉差異表達基因Fig.3 Differentially expressed genes of flue-curedtobacco leaves from Luonan

由表2可知，與隴縣相比，洛南煙區上調差異表達基因達到顯著水平的GO條目有10個［錯誤發現率（FDR）＜0.05］，其中生物學過程5個、分子功能4個、細胞組分1個，分別占50%、40%和10%。生物學過程主要為節律過程（GO:0048511，P）、晝夜節律（GO:0007623，P）、響應二糖刺激（GO:0034285，P）、蔗糖刺激（GO:0009744，P）、果糖刺激（GO:0009750，P）。分子功能主要為原葉綠素酸酯還原酶活性（GO:0016630，F）、氧化還原酶活性（GO:0016628、GO:0016627，F）和水解酶活性（GO:0016798，F）。差異表達基因富集的細胞組分主要涉及胞外區（GO:0005576，C）。

圖4 洛南煙區烤煙煙葉差異表達基因富集分析Fig.4 Analysis of differentially expressed genes of flue-cured tobacco leaves from Luonan

表2 洛南煙區烤煙煙葉上調差異表達基因GO功能分類Tab.2 GO function classification of differentially expressed up-regulated genes of flue-cured tobacco from Luonan

由表3可知，與隴縣相比，洛南煙區下調差異表達基因達到顯著水平的GO條目有33個（FDR＜0.05），其中生物學過程19個、分子功能13個、細胞組分1個，分別占57.58%、39.39%和3.03%。生物學過程主要為次級代謝（GO:0019748，P）、倍半萜類代謝（GO:0016106、GO:0051762、GO:0051761、GO:0006714，P）、萜烯代謝（GO:0042214，P）、萜類化合物代謝（GO:0016114、GO:0042214，P）、營養生長向生殖生長轉變時間調控（GO:0048510，P）、分生組織相變時間調控（GO:0048506，P）、發育調控（GO:0040034，P）、類異戊二烯合成（GO:0008299、GO:0006720，P）、脂類合成（GO:0008610，P）、苯丙烷代謝（GO:0009698，P）、氨基酸衍生物合成（GO:0006575，P）、芳香族化合物合成（GO:0019438，P）過程。分子功能主要為α-蛇麻烯合成酶活性（GO:0080017，F）、反式-E-β-石竹烯合成酶活性（GO:0080016，F）、碳-氧裂解酶活性（GO:0016838、GO:0016835，F）、腺苷酸環化酶活性（GO:0009975，F）、催化活性（GO:0003824，F）、主動跨膜轉運蛋白活性（GO:0015291、GO:0022804，F）、裂解酶（GO:0016829，F）、陽離子轉運蛋白活性（GO:0015294，F）、轉運蛋白活性（GO:0015293，F）及轉移酶活性（GO:0016765、GO:0016740，F）。細胞組分主要位于細胞內膜系統（GO:0012505，C）。

表3 洛南煙區烤煙煙葉下調差異表達基因GO功能分類Tab.3 GO function classification of differentially expressed down-regulated genes of flue-cured tobacco leaves from Luonan

2.4 烤煙差異表達基因代謝途徑分析

由表4可知，與隴縣相比，在洛南煙區煙草葉片中差異表達20倍以上的上調基因共有152個，有13個基因功能已知，其余均為未知功能蛋白。

已知的上調表達功能基因主要分為4類：①光合色素相關基因。原葉綠素酸酯還原酶在開花植物依賴于光的顯綠過程中起重要作用［8］。捕光色素葉綠素a/b結合蛋白為光合系統蛋白，是與色素形成的色素蛋白復合體（LHC），LHC能將捕獲的光能迅速傳至反應中心并引起光化學反應，在光合作用和對各種環境的適應過程中發揮作用［9］。②細胞結構形成相關基因。果膠甲基酯酶抑制蛋白，果膠甲基酯酶（PME）是一種果膠酶，在細胞壁降解過程中起著重要作用［10］。堿性α-半乳糖苷酶在植物種子、幼苗、葉片及果實中均存在，參與種子萌發、葉片發育、果實成熟及低溫耐受等生理過程［11-12］。類萌發素蛋白是存在于植物體中的重要防御酶，既能調控植物特定的生長發育過程，又能在植物響應生物及非生物脅迫中發揮作用［13］。過氧化物酶前體在細胞器過氧化物酶體中被催化生成過氧化物酶，過氧化物酶與植物的抗逆性有關，是植物保護酶系的重要保護酶之一［14］。富含甘氨酸蛋白互作蛋白和富含脯氨酸蛋白（PRP）是一類細胞壁結構蛋白，在細胞壁的形成和細胞的防衛過程中有重要作用，其表達具有組織特異性并受發育階段特異性及多種環境因素的調控［15］。③細胞信號轉導相關基因。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SAPK8類蛋白是一大類特異性催化蛋白質絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的激酶家族，參與細胞中許多信號轉導途徑［16］。含NB-ARC結構域蛋白在植物超敏反應中發揮作用［17］。④轉錄因子類：富含甘氨酸結構域RNA結合蛋白通過與RNA相互作用來調節細胞的功能，從而適應多種逆境條件［18］。Drm3類蛋白、生長素抑制蛋白均參與生長素誘導基因的下調表達調控［19］。

表4 洛南煙區烤煙煙葉差異表達20倍以上的基因功能注釋Tab.4 Function of genes differentially expressed more than 20 times of flue-cured tobacco from Luonan

下調差異表達20倍以上的基因有86個，其中有8個基因功能已知，其余均為未知功能蛋白。半胱氨酸蛋白酶參與脅迫響應、組織分化、衰老等過程［20］。MYB類轉錄因子廣泛參與植物的生長發育和代謝調控過程［21］。RNA酶H家族蛋白，該酶具有核酸酶活性，催化DNA-RNA雜合體的RNA部分的核內降解，對細胞的增殖和分化起調控作用［22］。馬兜鈴烯合成酶是一種萜烯合成酶，能催化不同類異戊二烯中間產物使其環化［23］。肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）是木質素特異途徑的第一個關鍵酶，對木質素單體的生物合成起重要作用，而木質素對植物的結構與防御功能都具有重要作用［24-25］。Patatin 類蛋白1（PLP1）為一類酯酰基水解酶，參與植物生物脅迫與非生物脅迫過程［26-27］。生長素類蛋白是一類參與植物生長素產生和降解的重要蛋白［28］。肌醇-3-磷酸合成酶是植酸合成代謝中催化葡糖糖轉化為肌醇-3-磷酸的功能蛋白，植酸可以防止植物葉片褐變，提高植物的抗氧化性［29-30］。

3 結論與討論

在本試驗中通過對兩生態煙區烤煙品種秦煙96在打頂后15 d煙葉基因表達譜分析顯示，洛南生態煙區差異表達基因為2 058個，其中上調差異表達基因為962個，下調差異表達基因為1 096個。這些差異基因主要在植物生長發育、細胞信號轉導、物質代謝與運輸、抵御逆境等過程中發揮作用。葉綠素合成、碳水化合物代謝與萜類化合物代謝相關基因的差異表達可能是造成兩個生態區煙葉風格特色差異的內因。

適宜的溫度能滿足烤煙生長發育，有利于物質的積累和煙葉充分成熟，同時適宜的光照可以保證碳水化合物的合成積累及煙葉的色澤［31］。葉綠素在高溫和強光照下易發生降解，煙葉成熟期溫度過高，會破壞葉綠素，影響光合作用，從而使植物新陳代謝失調，明顯地影響煙株的生長、成熟和煙葉品質［32-33］。洛南煙區在烤煙打頂后煙葉葉綠素合成相關基因，如光合色素原葉綠素酸酯還原酶、捕光色素葉綠素a/b結合蛋白前體相關基因高度表達。洛南煙區的溫度有利于煙葉中葉綠素生物合成，從而促進了光合作用。整個生育期的平均氣溫與煙葉總糖和還原糖含量密切相關，平均氣溫適宜時總糖和還原糖含量較高，過高則不利于總糖和還原糖合成［34］。推測洛南煙區烤煙成熟前期溫度較為適宜，促進了碳代謝化合物相關基因高表達，提高了碳水化合物累積量，進而為后期次生代謝提供了充足的前體物質和能量，為萜類化合物合成創造了良好的前提條件。不同氣候條件如降雨量和降雨分布會影響土壤水分狀況與空氣濕度，導致煙草葉面腺毛分泌物發生變化，進而對煙葉香氣品質產生影響［35］。隴縣煙區煙葉萜類化合物、芳香族化合物基因表達量較高，如馬兜鈴烯合成酶基因。這可能是由于洛南煙區8月上旬平均氣溫與降雨量要高于隴縣煙區所致［36］。可見，生態因子對兩個生態煙區葉綠素合成、碳代謝和萜類代謝相關基因表達產生較大影響，導致兩地煙葉化學成分的差異。張松濤等［37］研究提出生態條件差異對細胞內核苷酸代謝、激素代謝、DNA復制和修復以及信號轉導相關基因的表達有一定影響。在本研究中也有類似發現，兩個生態區差異表達基因均涉及細胞結構（細胞壁）的形成、細胞信號轉導及參與非生物脅迫等過程。表明不同生態區煙葉風格特色的差異是由多基因參與調控的結果。

生態因子影響著細胞內眾多基因的表達，造成這些基因表達差異的原因尚不完全明晰。另外相關數據庫中基因的信息及功能注釋不太全面，也影響了數據分析的深度。此外，烤煙葉片基因差異表達還需通過熒光定量PCR進一步驗證。在差異表達20倍以上的基因中，還有一部分并未進行功能注釋，它們的差異表達對于兩個生態煙區烤煙風格特色形成的影響尚不清楚，需要進行更深入的研究。

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Analysis of Gene Expression Profiles of Flue-cured Tobaccos from Different Ecological Zones in Qinba Mountain Area

JIN Baofeng1,HU Qiang1,YE Weimin1,RUAN Zhi2,LI Xiaona3,CHEN Fucai2,GOU Wei2,CUI Zhiyan2,4,ZHANG Ling2,GAO Mei2,and ZHANG Lixin*2
1.Technology Center,China Tobacco Guangdong Industrial Co.,Ltd.,Guangzhou 510385,China
2.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China
3.College of Natural Resources&Environment,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China
4.Zhen'an County Tobacco Company of Shaanxi Province,Zhen'an 715000,Shaanxi,China

To investigate the formation mechanism of style characteristics of flue-cured tobaccos from different ecological environment conditions,the middle leaves of flue-cured tobacco cv.Qinyan96 grown in two ecological zones,i.e.Luonan County in Shangluo City and Longxian County in Baoji City（the control）were sampled 15 days after topping,and their gene expression profiles were preliminarily analyzed with Agilent tobacco oligo microarray.The results showed that,comparing with those from Longxian,of the 44 000 genes of leaves from Luonan,there were 2 058 differentially expressed genes,including 962（46.74%）up-regulated genes and 1 096（53.26%）down-regulated genes.Categorizing byfunction,those genes mainly involved in biological processes,including metabolism,response to external environment stimulation,physiological regulation;and mostly distributed in extracellular regions and endomembrane systems.Synthesis metabolism of carbohydrate was more active in leaves from Luonan,while that of terpenoid,phenylpropanoid and aromatic compound was active in leaves from Longxian.Metabolic pathway analysis indicated that genes related to cell signal transduction,transcription factor and involved in plant abiotic stress were of higher expression in leaves from both Luonan and Longxian.

Flue-cured tobacco;Ecological zone;Qinyan96;Gene;Microarray;Expression profile

S572.01

A

1002-0861（2015）12-0001-08

10.16135/j.issn1002-0861.20151201

2015-04-17

2015-06-15

廣東中煙工業有限責任公司科技計劃項目“‘雙喜’品牌秦巴生態煙葉關鍵技術研究與集成推廣”［粵煙工05XM-QK（2014）015］。

金保鋒（1973—），碩士，高級工程師，主要從事特色煙葉開發與應用研究。E-mail：jinbf@gdzygy.com；*

張立新，E-mail：zhanglixin@nwsuaf.edu.cn

金保鋒，扈強，葉為民，等.秦巴不同生態區烤煙基因表達譜分析［J］.煙草科技，2015，48（12）：1-8.JIN Baofeng,HU Qiang,YE Weimin,et al.Analysis of gene expression profiles of flue-cured tobaccos from different ecological zones in Qinba mountain area［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：1-8.

責任編輯 董志堅