應用RAPD技術分析女貞種質資源的遺傳多樣性與遺傳結構

趙峰,劉國民,李娟玲*,張恩華,張其文,符偉

1.海南廣播電視大學,海南海口570208

2.海南大學苦丁茶研究所,海南海口570228

應用RAPD技術分析女貞種質資源的遺傳多樣性與遺傳結構

趙峰1,劉國民2,李娟玲2*,張恩華2,張其文2,符偉2

1.海南廣播電視大學,海南海口570208

2.海南大學苦丁茶研究所,海南海口570228

本研究采用RAPD分子標記技術對我國7個野生居群共121份女貞種質材料進行遺傳多樣性分析。10條有效引物對121份女貞種質材料進行RAPD-PCR擴增，共擴增出94條DNA譜帶，其中80條為多態性帶，占總擴增帶數的85.11%，平均每個引物擴增出9.4條譜帶。分析結果表明，供試女貞材料在物種水平上具有豐富的遺傳多樣性，有效等位基因數Ne=1.4344，Nei’s基因多樣性H=0.2591，Shannon信息指數I=0.3959；但在居群水平上，女貞的遺傳多樣性水平較低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。女貞居群內的遺傳變異大于居群間的遺傳變異，居群間遺傳分化指數Gst=0.4067，總的遺傳變異中有40.67%的變異存在居群間，有59.33%的遺傳變異存在于居群內。女貞居群間基因交流有限，基因流(Nm)為0.7294＜1。

女貞;種質資源;遺傳多樣性;RAPD

女貞(Ligustrum lucidum Ait)系木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum）常綠灌木或小喬木，具有清熱解毒，抗菌消炎，健胃消積，去膩醒酒，止咳化痰，生津止渴，提神醒目明目益智和抗輻射，抗衰老，活血脈，強心利尿，降壓減肥，抑癌防癌，調節血脂等功效[1]。女貞是木犀科苦丁茶之重要種類之一，是一種珍貴的茶藥兩用植物，具有多種藥用價值和保健功能。女貞主要功能成份有多糖類、三萜類、黃酮類、苯醇類、磷脂類等化合物[2-15]，對紅細胞造血有促進作用，能加快血小板的流動性，減弱血小板之間的碰撞，使其不易粘連和聚集，更不易在血管內膜沉積，從而減緩和防止血栓形成，又可降低脂質內膜的沉積，改善老年人血小板的流動性，降低血液粘度，防治老年人的血栓性疾病和動脈粥樣硬化[16]。

RAPD標記（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）是Williams和Welsh等于1990年利用PCR技術發展起來的一種DNA多態性標記。它是建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子標記技術。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物,在熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、EB(溴化乙錠)染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。RAPD技術現已廣泛應用于植物的遺傳多樣性、品種鑒定、系譜分析及進化關系等研究領域，但在女貞種質材料的遺傳多樣性及遺傳結構等方面，目前未見有前人的研究報道。本研究采用RAPD分子標記技術，選取我國7個居群中的121份女貞種質材料，從DNA分子水平上探討女貞種質資源的親緣關系及遺傳多樣性。旨在通過這一工作為更加科學合理地保護與開發利用女貞種質資源提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料來源

從海南大學苦丁茶研究所種質資源圃收集的7個居群121份種質材料上，分別取嫩葉或嫩芽作為本實驗的供試材料（表1）。

表1　用于RAPD分析的121份女貞種質材料及其來源Table 1 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait used for RAPD along with their origins

1.2方法

1.2.1總DNA的提取采用李娟玲[17]等的改良CTAB法提取121份女貞種質材料基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的完整性；稀釋100倍，用紫外分光光度計測定230 nm、260 nm和280 nm的吸光度，即OD值，計算所提DNA的濃度及估測DNA的純度。

1.2.2PCR擴增反應反應在icyclerTMThermal Cycler型PCR儀上進行。采用優化后的RAPD反應體系和擴增程序，即：每25 μL體積中，10×反應buffer 2.5 μL，25 mM的MgCl23.0 μL，0.5 μL dNTPs，Taq酶0.4 μL，引物1.0 μL，DNA模板2.5 μL。Taq DNA polymerase和4×dNTP mix均購自上海申能博彩生物科技有限公司，Operon系列引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成(表2)。

RAPD-PCR擴增程序94℃預變性4 min，然后按94℃變性30 s，38℃退火45 s，72℃延伸120 s，進行40個循環，最后72℃延伸10 min，16℃保存。每個反應重復一次。

1.2.3擴增產物的檢測取8 μL擴增產物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，在Gel Doc XR型凝膠成像分析系統下照相并記錄。以100 bp plus DNA Ladder（購自中科瑞泰北京生物科技有限公司）作為對照分子量標準。

1.2.4PCR擴增譜帶的統計和分析將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”由此生成0和1原始矩陣，統計每個引物擴增出的總帶數和其中的多態性帶數，計算多態性帶百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB），PPB=多態位點數/位點總數。用NTSYS-PC(2.02j)軟件中的SIMQUAL程序計算Jaccard遺傳相似系數(Genetic similarity，GS)[18]，并獲得遺傳相似系數矩陣。計算公式：GSij=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij指兩個個體間共有的帶數，Ni+Nj指兩個個體所有帶數之和；用NTSYS-PC(2.02j)軟件中的SAHN程序和UPGMA(Unweighted pair group mean average)方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成系統樹圖。

應用POPGENE1.31軟件在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態下，對所供試的種質材料進行遺傳參數分析，分別計算了觀測等位基因數(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(Effective number of alleles,Ne)、Nei′s(1973)基因多樣性指數(Nei′s gene diversity,H)、Shannon′s信息指數(Shannon′s infornation index,I)、多態性帶百分率（Percentage of polymorphic bands,PPB），群體總基因多樣性(Total gene diversity,Ht)、群體內基因多樣性(Gene diversity within populations,Hs)、群體間的遺傳分化系數(Coefficient of gene differentiation,Gst)、基因流（Gene flow,Nm）、Nei′s(1978)遺傳距離(Genetic distance，D)和遺傳一致度(Genetic identity，I)。

表2　RAPD所用的引物Table 2 The used RAPD primers with their sequences

2　結果與分析

2.1基因組DNA的提取與檢測

用改良CTAB法提取121份女貞種質材料的基因組DNA，經用紫外分光光度計檢測其OD值。結果顯示，OD260/OD280均在1.8左右，表明干擾RAPD分析的多糖類和三萜類化合物等雜質含量低，所提取的基因組DNA純度較高。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并與Lambda DNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers比較，片段無彌散現象（見圖1）。

圖1　部分女貞種質材料的總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖M為Lambda DNA/HindШ+EcoRMarkersFig.1Agarose gelelectrophoresis of total DNAof the different germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

2.2RAPD擴增結果

用上述的所選的10個引物對121份女貞種質材料進行RAPD擴增，可獲得帶型清可辨的DNA指紋圖譜，其擴增結果見表3。在這121份種質材料中，10個引物共擴增出94條清晰可重復DNA譜帶，其中80條為多態性條帶，占總擴增條帶數的85.11%(見表3)。平均每個引物擴增的帶數為9.4條，大多數擴增條帶的分子量在200 bp～2100 bp之間。

表3　引物序列及其多態性Table 3 The sequences of primers used and their polymorphism

2.3女貞不同地理來源材料間的遺傳多樣性分析

根據供試種質材料的起源地域，女貞種質材料可分為貴州湄潭、貴州臺江縣、湖南祁東步云橋鎮、湖南祁東白鶴鎮排山村、湖南祁東白鶴鎮高原村、四川巴中市以及南京農大校園7個居群。基于RAPD數據，利用PopGene軟件分析女貞7個居群的遺傳多樣性，其結果如表4所示。

遺傳多樣性分析結果表明，在物種水平上，女貞的遺傳多樣性水平較高，平均每個位點的多態位點百分率PPB=85.11%，有效等位基因數Ne=1.4344，Nei’s基因多樣性H=0.2591，Shannon信息指數I=0.3959；但在居群水平上，女貞的遺傳多樣性水平較低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。

Shannon信息多樣性指數顯示了各居群的遺傳變異由高到低依次為南京農大校園居群＞湖南祁東步云橋鎮居群＞湖南祁東白鶴鎮高原村居群＞四川巴中市居群＞湖南祁東白鶴鎮高原村居群＞貴州湄潭居群＞貴州臺江縣居群(見表2)。各居群間均遺傳多樣性差異較顯著，其中南京農大校園居群的遺傳多樣性水平最高(PPB=55.32%,H=0.2069,Ne=1.3613，I=0.3046）。

表4　女貞居群的遺傳多樣性Table 4Genetic diversity of germplasm materials ofLigustrum lucidum Ait

2.4女貞居群間的遺傳結構和遺傳變異分析

基于RAPD分析數據，計算供試女貞種質材料總的遺傳多樣性(Ht)和居群內遺傳多樣性(Hs)，在此基礎上計算不同居群間的遺傳分化系數(Gst)(見表5)。女貞不同居群總的基因多樣度Ht為0.2453，其中居群內的基因多樣性Hs為0.1455；基因流(Nm)為0.7294＜1，表明女貞居群間基因交流有限。女貞居群間遺傳分化指數Gst=0.4067，表明總的遺傳變異中有40.67%的變異存在居群間，有59.33%的遺傳變異存在于居群內。

表5　女貞居群基因多樣性Nei’s分析Table 5 Nei’s(1987)genetic structure analysis amongLigustrum lucidum Ait

2.5女貞種質材料的聚類分析

根據對RAPD擴增條帶分析的結果，采用UPGMA法對121份女貞不同居群種質材料進行分析，建立聚類分析圖(如圖3所示)。聚類分析結果表明，所有供試材料可顯著地聚為四類群。第一類群中來自貴州省湄潭縣和臺江縣的材料首先分別按地理來源的不同聚為兩小類，然后再聚為貴州類群；來自湖南祁東縣三個居群的種質材料聚為湖南類群，此類群中不同居群的材料間存在交叉聚類現象，表明湖南祁東縣三個居群間有明顯的基因交流；此外，來自四川巴中市的材料和南京農大的材料也分別聚為四川巴中類群和南京農大類群。可見，不同居群的差異以及起源地域差異都可以從聚類分析圖中清晰地反映出來。

3　討論與結論

3.1RAPD分子標記的可靠性

RAPD分子標記技術存在的最大問題是重復性不太高。但諸多實例證實，在應用過程中只要認真優化最佳的反應體系和程序設計，并保持同一反應體系和同一擴增程序，完全可以得到重復性好的結果，是一種較為有效的分子標記方法[19]。本研究的結果也表明，在嚴格按照本實驗前期建立的最佳反應條件及程度進行反應所擴增出的DNA多態性良好、條帶清晰，且重復性好。在進行結果分析時，雖然多態性位點越多，所得到的結果從理論上來說越可靠，但需要付出的人力物力也相應增加。此外，當多態性位點增加到一定程度，增加的位點對準確性的貢獻已有限。Pejic等[20]、周澤揚等[21]、洪棋斌等[22]的研究結果基本相近，他們均認為多態性位點數達到或超過70個時，可得到較為可靠的信息。本研究發現，應用10條有效引物對121份供試材料進行RAPD擴增，共獲得多態性DNA譜帶有96條，以此為基礎的分析結果已趨于穩定。此外，本文所獲得的聚類結果與可以把不同的材料完全分開，也與材料的地理起源基本一致。因此，作者認為引物數為10時，分析的結果不再變化，本研究所得到的結果真實可靠地反映了供試女貞的遺傳多樣性。

圖3　121份女貞種質材料的聚類分析圖Fig.3 The RAPD cluster analysis dendrogram for 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

3.2女貞的遺傳多樣性與遺傳分化

Hamrick等[23]曾總結了662種植物的遺傳多樣性和遺傳分化所得出的平均值為：PPB=51.3%，Na=1.97，H=0.150，Gst=0.228；而其中分布區較為廣泛的物種的遺傳多樣性和遺傳分化所得出的平均值為：PPB=67.8%，Na=2.11，H=0.257，Gst=0.033；女貞物種水平的遺傳多樣性水平參數分別為PPB=85.11%，Na=1.8511，H=0.2591，Gst=0.4067。與Hamrick等所得出的平均值相比，女貞的多態位點百分率，Nei’s基因多樣性指數及遺傳分化參數均明顯偏高，說明女貞具有較高的遺傳多樣性。女貞類群間遺傳分化指數Gst=0.4067，表明總的遺傳變異中有40.67%的變異存在類群間，有59.33%的遺傳變異存在于類群內，類群內的遺傳分化大于類群間的分化。影響植物類群間遺傳分化的因素很多，基因流一向被視為是使類群遺傳結構均質化的主要因素之一，具有有限基因流的物種往往較那些具有廣泛基因流的物種有較大的遺傳分化[24]。女貞的基因流僅為0.7294＜1，表明女貞居群間基因交流有限。因此，有限的基因流可能是引起女貞類群間分化的主要原因之一。

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Application of RAPD Technology to Analysis on the Genetic Diversity and Structure of Ligustrum lucidum Ait

ZHAO Feng1,LIU Guo-min2,LI Juan-ling2*,ZHANG En-hua2,ZHANG Qi-wen2,FU Wei2
1.Hainan Radio and TV university,Haikou 570105,China
2.Kudingcha Research Institute,Hainan University,Haikou 570228,China

The genetic diversity of the 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait from 7 wild populations in China was detected by RAPD molecular markers in the study.10 primers were used to amplify samples of L.lucidum Ait.And 94 DNAbands were got,80 of which was polymorphic,with the percentage of polymorphic bands(PPB)of 85.11%.On average, 9.4 DNA bands were amplified by each primer.The results showed that there was rich genetic diversity in the species level, with Ne=1.4344,H=0.2591,I=0.3959;but lower at the population level(PPB=37.08%,Ne=1.2590,H=0.1455,I= 0.2127).The genetic variation in L.lucidum Ait populations was higher than that among populations.The coefficient of gene differentiation(Gst)was 0.4067,which showed that there was 40.67%of genetic variance among the populations,and 59.33%in the populations.there were limited gene interflows among the populations of L.lucidum Ait.The gene flow(Nm) was 0.7249＜1.

Ligustrum lucidumAit;germplasm resources;genetic diversity;RAPD

S571.1文獻標示碼:A

1000-2324(2015)02-0161-07

2014-10-27

2014-11-10

海南省教育廳基金資助項目(Hjkj2012-51);國家自然科學基金資助項目(39860048)

趙峰(1981-),女,山東章丘人,講師,農學碩士,主要從事植物資源和飼料學研究.Email:928662418@qq.com

Author for correspondence.Email:ljl0728@126.com