p38信號通路參與P19CL6細胞早期心肌分化*

黃巧麗， 李 濤， 姜科聲， 劉羿男， 李賢慧， 劉元偉

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.北京大學醫學部細胞生物學系，北京100191;3.武警后勤學院生物化學與分子生物學教研室，天津 300162;4.浙江醫院心內科，浙江杭州 310013)

p38信號通路參與P19CL6細胞早期心肌分化
*

黃巧麗1， 李 濤1， 姜科聲1， 劉羿男2， 李賢慧3， 劉元偉4

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.北京大學醫學部細胞生物學系，北京100191;3.武警后勤學院生物化學與分子生物學教研室，天津 300162;4.浙江醫院心內科，浙江杭州 310013)

以P19CL6小鼠畸胎瘤細胞心肌分化為模型，研究了p38信號通路在干細胞心肌分化早期階段的作用.在誘導劑二甲基亞砜作用下，P19CL6細胞分化為自發跳動的心肌細胞，表達心肌標志性基因.在誘導分化過程中，p38信號通路活化.采用特異性抑制劑SB203580在早期分化階段封閉p38信號通路，結果發現:高劑量SB203580誘導細胞凋亡;低劑量SB203580抑制心肌祖細胞標志基因GATA4和Nkx2.5的表達，并顯著下調生心性信號分子BMP2和BMP4的表達.而過表達p38 α質粒則能促進P19CL6細胞表達GATA4和Nkx2.5.表明p38信號通路正性調控P19CL6細胞的早期心肌分化，并維持細胞的增殖和存活能力.

P19CL6細胞;心肌分化;p38激酶;信號通路

干細胞向心肌分化的過程中，首先分化為中胚層細胞，繼而分化為心肌前體干細胞，最終發育為自發搏動的功能性心肌細胞.在心肌多步驟程序分化過程中，涉及到多個信號通路的時空啟閉，包括骨形成蛋白(BMP)、Wnt和Notch等信號通路.已證實Wnt和Notch信號促進心肌早期分化，但抑制晚期分化.這表明信號通路的時空啟閉關乎干細胞在分化道路上的命運選擇［1］.目前干細胞研究中一大熱點是:利用小分子化合物對特異的信號通路進行調制，從而引發定向分化或增強誘導分化效率［2］.

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數細胞內，在介導胞內信號轉導中發揮著重要的作用.MAPK通路大致分為p38，ERK，JNK和ERK5四個亞家族，通過對不同底物蛋白的磷酸化修飾，將胞外刺激信號轉導至胞內，引發細胞生物學反應，廣泛參與了細胞的增殖、分化、凋亡等生物學事件［3］.

本文對p38信號通路在P19CL6細胞早期心肌分化中的作用進行了初步研究.P19CL6細胞是Habara－Onkubo等將小鼠P19畸胎瘤細胞經過多次傳代建立的一個亞細胞系，分化潛能主要表現為中胚層方向定向分化.與P19細胞需要懸浮誘導不同的是，P19CL6細胞在貼壁條件下經二甲基亞砜(DMSO)誘導，可以簡便高效地獲得分化的心肌細胞.P16CL6細胞已經成為比較公認的研究干細胞向心肌細胞分化的細胞模型.采用經典的二甲基亞砜誘導P16CL6細胞8～12 d，分化效率可達到70%～90%.

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

P19CL6小鼠畸胎瘤干細胞為北京大學醫學部周春燕教授惠贈.pcDNA3－HA－p38 α質粒由以色列大學Engelberg教授饋贈;pEGFP－N1質粒為Clontech公司產品.Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司，總RNA提取試劑(RNAVzol)及質粒提取試劑盒購自北京威格拉斯公司，Annexin V凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽公司;MMLV反轉錄酶購自 Promega公司;Taq DNA聚合酶購自New England Biolabs公司;Hoechst33342購自Sigma公司.SB203580和BCA法蛋白定量試劑盒購自碧云天公司，抗α－actinin抗體購自Sigma公司，抗p－p38和總p38抗體購自Cell Signaling公司，抗GAPDH抗體、辣根過氧化酶及FITC標記的二抗均購自北京中杉金橋公司.PCR引物由北京奧科公司合成.

1.2 P19CL6細胞的培養及貼壁誘導分化

液氮凍存的P19CL6細胞解凍后常規培養傳代，培養于:α－MEM培養基 +10%胎牛血清(FBS)+100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(雙抗).將P19CL6細胞進行消化、計數，按3.7×105細胞密度用含1%二甲基亞砜(細胞培養級)的誘導培養基接種于直徑60 mm的細胞培養皿內.待細胞貼壁后，每隔2 d換液1次.誘導當天記為0 d.貼壁誘導6 d后撤除二甲基亞砜，繼續培養，隔天換液.

1.3 噻唑藍(MTT)法檢測細胞相對活力

將P19CL6細胞以1.8×104/孔接種至96孔板上，1%二甲基亞砜誘導，同時加入不同劑量的SB203580(0，5，10，20 μmol/L).37℃孵育48 h后終止培養，棄去孔內培養液.每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結晶充分溶解.在酶聯免疫檢測儀490 nm波長處測量各孔的吸光度(A490nm).按下列公式計算細胞存活率:

每組設4個復孔，實驗重復3次，用配對t檢驗法進行統計分析.

1.4 逆轉錄PCR及實時PCR

RNA提取方法參照產品說明.在1×106細胞中加入1 mL總 RNA提取試劑，冰上放置5 min，使細胞裂解;加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻，冰上靜置2 min，使核蛋白解離;4℃12 000 r/min離心15 min;取上清，加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，冰上靜置10 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min;棄上清，在RNA沉淀中加入1 mL 75%乙醇溶液混勻;4℃7 500 r/min離心10 min;棄上清，充分晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解，測定其濃度及純度.取5 μg總RNA經MMLV逆轉錄酶逆轉錄成cDNA作為PCR的模板.將5 μg總RNA與2 μL隨機引物溶液(0.5 μg/μL)混合，加DEPC水溶液補足至終體積12.5 μL.70℃水浴變性5 min，置冰上2 min.每管中再加入以下試劑:4 μL反應緩沖液，2 μL脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)溶液(10 mmol/L)，0.5 μL RNA酶抑制劑溶液(40 U/μL)，1 μL MMLV溶液(200 U/μL).加DEPC水溶液補足至20 μL后混勻，輕離心，37℃反應1 h.70℃滅活5 min，離心1 min，－80℃保存備用.

PCR引物及擴增條件為:18s基因正向引物5'－GTAACCCGTTGAACCCCAATT－3'，反向引物5'－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－3，擴增條件為58℃退火，共25個循環，產物大小151 bp;GATA4基因正向引物5'－CTCGATATGTTTGATGACTTCT－3'，反向引物5'－CGTTTTCTGGTTTGAATCCC－3'，擴增條件為60℃退火，共40個循環，產物大小為400 bp;α－MHC基因正向引物 5'－ACCGTGGACTACAACAT－3'，反向引物5'－CTTTCGCTCGTTGGGA－3'，擴增條件為60℃退火，共35個循環，產物大小為287 bp.

實時PCR采用TOYOBO公司的SYBR Green Real－time PCR Master Mix在ABI7700型定量PCR儀上進行.反應體系為:7.5 μL 2×SYBR Green Master Mix緩沖液，0.25 μL正向引物溶液(10 pmol/μL)，0.25 μL反向引物溶液(10 pmol/μL)，1 μL cDNA模板溶液，滅菌去離子水補足至15 μL.PCR反應條件:95℃變性10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環.測定樣品的Ct(Cycle threshold，循環閾值)，通過計算2－△△Ct來比較不同樣品之間特定基因的表達差異.結果來自2次平行實驗各3次重復，以平均值±標準差的形式在柱狀圖中顯示.PCR引物見表1.

表1 引物序列信息

1.5 免疫熒光鑒定

用細胞刮輕輕刮取跳動細胞團，離心，棄上清;將沉淀加入到含有OCT包埋劑的Eppendorf管內，然后浸入液氮中速凍15 s;置冰凍切片機上切片，切片厚度要求為7 μm，60℃烘干.4%多聚甲醛溶液于室溫固定切片15 min;0.5%的Triton X－100/磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽吐溫緩沖液)膜打孔10 min;2%牛血清白蛋白(BSA)溶液37℃孵育30 min，以封閉非特異性結合位點;2%BSA溶液稀釋的抗α－actinin抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜;磷酸鹽吐溫緩沖液漂洗3遍后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光二抗，濕盒內避光孵育30 min;磷酸鹽吐溫緩沖液充分漂洗后，1 μg/mL Hoechst33342核復染色5 min，漂洗后，緩沖甘油封片(V(磷酸鹽緩沖液)∶V(甘油)= 1∶9)，置熒光顯微鏡(Fluoview300，Olympus)下觀察.

1.6 蛋白印跡

用冰預冷的磷酸鹽緩沖液將細胞洗2遍，將細胞刮下收集到Eppendorf管中，5 000 r/min離心5 min沉淀細胞，加入預冷的裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)，1%壬基酚聚氧乙烯醚(NP－40)，0.5%脫氧膽酸鈉)，將細胞重懸，冰上孵育30 min后，12 000 r/min離心15 min，上清即為全細胞裂解液.BCA法進行蛋白定量.30 μg蛋白煮沸后，10%SDS－PAGE電泳轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗雜交，辣根過氧化物酶標記二抗孵育后化學發光法顯色.

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

P19CL6細胞經胰酶消化收集:每樣本細胞數為1×106，1 000 r/min離心3 min棄去培養液.用結合緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min.用100 μL的Annexin V－FITC標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞用孵育緩沖液洗1次.上機前5 min碘化丙啶(PI)染色.流式細胞儀分析:流式細胞儀激發光波長用488和515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，大于560 nm的濾器檢測PI.

1.8 質粒提取及轉染

質粒大量提取方法見威格拉斯公司產品說明書.轉染的前一天，消化細胞、計數.以4×105/孔細胞濃度接種于6孔板中，當細胞匯合度達80%～90%時開始轉染.每孔細胞需2 μg純化質粒，用50 μL無血清、無雙抗的培養基稀釋.每孔細胞需要4 μL Lipofectamin2000，用50 μL無血清、無雙抗的培養基稀釋，混勻后室溫靜置5 min.分別將質粒與脂質體充分混勻，室溫靜置20 min，將混合物加入6孔板，輕搖使其均勻分布在孔板內.將細胞放置于CO2培養箱中37℃培養.6 h后將培養基更換為含1%二甲基亞砜的誘導培養基繼續培養.

1.9 統計方法

數據以均值±標準差表示，采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗和單因素方差分析.P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異.

2 結果

2.1 P19CL6細胞心肌誘導分化模型的建立

如圖1(a)所示，常規培養的P19CL6細胞貼壁生長，呈不規則長梭形，立體感強，邊緣光滑，具有折光性.用1%二甲基亞砜對其進行誘導，細胞匯合后以集落的方式生長，在單層的細胞上可見許多個復層生長的細胞團，類似胚胎干細胞誘導分化過程中形成的“擬胚體樣”結構，即發生三胚層分化，經外胚層和內胚層釋放的信號分子誘導中胚層細胞定向分化為心肌細胞.誘導后的8 d，在細胞復層生長的區域開始零星出現跳動的細胞群.隨著誘導分化繼續進行，自發節律性跳動的細胞團數目逐步增加，搏動區域連接成片，一般于誘導12 d達到高峰，最高有80%的細胞團產生跳動.

將未誘導的P19CL6細胞及誘導12 d的細胞冰凍切片，分別進行心肌細胞特異的α－輔肌動蛋白(α－actinin)免疫熒光染色.如圖1(b)所示，未誘導的P19CL6檢測不到心肌細胞α－輔肌動蛋白的表達，而誘導12 d的P19CL6大部分細胞都表達α－輔肌動蛋白，表明P19CL6細胞被成功誘導為心肌細胞.

圖1 P19CL6細胞的心肌分化

2.2 p38激酶在心肌誘導分化過程中活化時相的變化

心肌細胞的分化是一個按照既定分子程序進行的過程，但在分化過程中根據特異性基因的表達，可以劃分出幾個關鍵性的分化階段.干細胞向心肌分化的啟動階段為中胚層分化，其后分化為生心性中胚層，細胞分化為心肌定向祖細胞，標志為心肌特異轉錄因子GATA4，Nkx2.5的表達;然后由心肌特異轉錄因子啟動心肌結構基因、功能性基因表達，如α肌球蛋白重鏈(α－MHC);其后已分化的心肌細胞逐步成熟，最終表現出自發性節律性搏動.通過RT－PCR檢測P19CL6細胞誘導分化過程中分化標志基因的表達，可以發現:未分化的P19CL6細胞不表達GATA4和α－MHC;分化4 d可檢測到GATA4表達;分化8 d方可檢測到α－MHC表達(見圖2(a)).據此，可將P19CL6細胞心肌分化大致劃分為早期(1～4 d)、中期(4～8 d)和晚期(8～12 d)3個階段，其中早期階段主要的細胞分子事件為干細胞分化為心肌祖細胞，表達GATA4等標志基因.

為了解p38通路是否參與心肌程序分化，提取各分化階段的P19CL6細胞蛋白進行蛋白印跡實驗，通過檢測活化形式的磷酸化p38來了解p38通路在心肌分化過程中是否活化.如圖2(b)所示，p38蛋白磷酸化水平隨分化過程逐步增強，提示p38通路參與心肌程序分化.

2.3 SB203580對細胞存活和凋亡的影響

為了解p38通路是否參與心肌程序分化，使用特異性抑制劑SB203580封閉p38激酶活性，檢測抑制 p38通路對心肌分化的影響.首先在P19CL6細胞分化培養基中加入不同劑量的SB203580，培養2 d后經MTT實驗檢測細胞相對活力.結果顯示，高劑量(20 μmol/L)SB203580極大地抑制了細胞活力，而較低劑量(1，5 μmol/L) SB203580對細胞活力影響較小(見圖3(a)).進一步檢測發現，20 μmol/L SB203580誘導2 d，導致細胞大量脫落漂浮(見圖3(b)).通過Annexin V－PI雙染流式分析發現，20 μmol/L SB203580誘導P19CL6細胞凋亡(見圖3(c)).統計發現，SB203580組(79.7±5.0)%的細胞發生凋亡，而對照二甲基亞砜誘導組細胞凋亡率為(5.6±2.7)%(見圖3(d)).這些結果表明，p38信號通路參與了P19CL6細胞早期分化階段，起維持細胞正常活性及增殖的作用，阻斷p38信號通路可誘發細胞凋亡.

圖2 P19CL6分化期間p38級聯反應激活

圖3 高濃度SB203580誘導早期分化階段P19CL6細胞凋亡

2.4 SB203580對P19CL6細胞早期分化的抑制

低劑量SB203580對P19CL6細胞無明顯的毒性，基本不影響細胞增殖，不誘發凋亡.P19CL6細胞誘導分化1～4 d中持續加入1或5 μmol/L SB203580，4 d末提取RNA進行實時PCR，結果發現，5 μmol/L SB203580抑制GATA4，Nkx2.5的表達(見圖4(a)和(b)).表明抑制p38信號通路導致心肌早期分化效率明顯降低，降低了心肌特異性轉錄因子的表達，抑制了心肌祖細胞的產生，提示p38信號通路正性調控早期心肌分化.

為進一步探究p38信號通路調控早期心肌分化的機制，通過實時PCR檢測心肌分化關鍵信號分子BMP2和BMP4的表達.結果發現，P19CL6細胞心肌分化過程中BMP2和BMP4的表達明顯增高，但5 μmol/L SB203580處理顯著抑制了二者的表達(見圖4(b)和(c)).本結果提示，p38信號通路誘導生心性信號分子的表達，正性調控早期心肌分化.

圖4 低濃度SB203580抑制P19CL6細胞早期分化

圖5 p38α過表達促進P19CL6細胞早期分化

2.5 過表達p38信號對P19CL6細胞早期分化的促進

為進一步明確p38信號通路對早期心肌分化的調控，進行了p38α質粒過表達實驗.如圖5(a)所示，通過脂質體介導的質粒轉染，實驗組P19CL6細胞獲得了p38蛋白的高表達.EGFP或p38α質粒過表達的P19CL6細胞，再按常規程序經1%二甲基亞砜誘導4 d后提取RNA，通過實時PCR檢測早期心肌分化標志基因的表達.結果如圖5(b)和(c)所示，p38α蛋白過表達組的GATA4和Nkx2.5基因表達明顯增高，其中GATA4基因表達增高了(3.0±0.3)倍，Nkx2.5基因表達增高了(1.7±0.3)倍.因此，本實驗證明p38信號通路正性調控早期心肌分化.

3 討論

干細胞具有全能性、無限增殖和多向分化的潛能，能分化為包括心肌在內的多種細胞，為缺血性心臟病的徹底治愈提供了希望.如何提高干細胞向心肌分化的效率是目前的研究熱點［1－2］.利用小分子化合物在特定發育階段，特別是分化早期對特異的信號通路進行調控，是改善誘導分化效率的重要發展方向.

干細胞向心肌細胞分化有一定的程序過程.經歷了從多潛能干細胞向前體心肌祖細胞分化，最終發育為終末分化成熟心肌細胞的程序化過程，涉及細胞內復雜的信號轉導及基因調控過程.已發現多個信號分子在心肌分化的調控中發揮了關鍵作用，包括BMP，Wnt，Notch和FGF等，對心肌分化的影響呈現階段特異性特征.這啟迪了研究者根據心肌分化的特定時間段改變誘導劑組分，以一種“多階段性”的方式誘導干細胞向心肌分化［1－2］.多個研究報告顯示，BMP2，BMP4及同家族的Activin A蛋白均可誘導干細胞向心肌分化，但使用BMP信號通路的抑制劑dorsomorphin亦能大幅促進心肌分化，關鍵在于dorsomorphin加藥階段只能限于起始分化最早的24 h［4］.由于Wnt信號促進心肌早期分化，但抑制晚期分化，在干細胞早期分化階段添加 Wnt信號激動劑CHIR99021，或在細胞發育為中胚層細胞后添加Wnt信號抑制劑KY02111，均可促進干細胞向心肌的分化［5－6］.

調制MAPK通路可以影響心肌分化.MAPK信號通路家族是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細胞增殖分化關系密切，其家族成員中ERK激酶通路通常介導生長因子信號，而p38和JNK激酶通路通常介導應激性信號，包括各種理化刺激、炎癥及細胞因子刺激，ERK4激酶通路通常參與增殖及壓力應激信號的傳導［3］.在胚胎干細胞中的研究發現，p38信號通路在心肌早期分化階段發揮著重要作用.p38信號通路的開啟與否決定了干細胞的早期分化命運.p38激酶活化的細胞選擇中胚層分化道路，最終分化為心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌等中胚層來源的組織細胞;而p38激酶活性抑制的細胞選擇發育為外胚層細胞，最終分化為神經細胞.因此，p38信號通路可以發揮“開關”的作用，調控干細胞的分化方向，可能與調控p53蛋白的穩定性相關［7－10］，但具體機制尚不清楚.此外，p38通路也參與了晚期心肌分化.在異丙腎上腺素、血管緊張素誘導的胚胎干細胞晚期心肌分化中，抑制p38激酶會降低自發搏動的擬胚體數目，抑制心肌標志基因的表達［11－12］.

本實驗通過抑制劑及質粒轉染實驗，在P19CL6畸胎瘤干細胞中驗證了p38信號通路對于早期心肌分化的關鍵作用.本研究發現，高劑量的p38激酶抑制劑SB203580處理阻斷了早期分化的P19CL6細胞增殖，大量誘導凋亡，提示p38信號通路維持了早期分化階段干細胞的增殖和存活能力.盡管文獻中經常使用20 μmol/L劑量的SB203580封閉p38通路，同時并不干擾細胞的存活，但在本實驗中卻出現了大量的細胞凋亡，推測原因為在直徑60 mm的皿中P19CL6細胞誘導分化的鋪板密度為3.7×105細胞，細胞密度極低，因此無法耐受高劑量的SB203580.適度劑量的SB203580則干擾心肌早期分化，導致定向心肌祖細胞標志基因GATA4，Nkx2.5顯著下調.同時，SB203580抑制了生心性關鍵信號分子BMP2和BMP4的表達.由于BMP信號對GATA4和Nkx2.5基因的表達有重要的誘導作用，因此封閉p38通路可以阻斷心肌分化的進程.p38表達質粒轉染實驗同樣證明了 p38通路可以誘導 GATA4和Nkx2.5的表達，從而促進早期心肌分化.總的來說，本實驗顯示，p38信號通路在P19CL6細胞心肌分化的早期階段發揮了重要作用，主要體現在維持細胞增殖和存活能力，驅動向定向心肌祖細胞的分化.

本實驗的結果提示，早期活化p38通路具有提高心肌分化效能的潛力.但不可忽視的是，亦有文獻報道心肌分化早期抑制p38通路能夠微弱地促進心肌分化［13－14］，顯示了p38通路在細胞分化中的復雜作用.例如，在BMP2誘導的骨髓間充質干細胞心肌分化過程中，加入SB203580反而能促進心肌標志物的表達［15］.干細胞誘導分化受到細胞系、血清、誘導劑種類、劑量等多種因素的影響.本實驗采用P19CL6畸胎瘤細胞系，并采用貼壁誘導，與文獻［13－14］報道的用胚胎干細胞擬胚體培養、END2條件培養基誘導存在一定的差異.因此，本實驗通過SB203580抑制p38通路，未發現明顯的促心肌分化效應.總之，由于p38通路在干細胞分化中的重要作用，對其具體的作用及機制仍需要進行進一步的實驗研究.

［1］Liu Jianfang，Zhang Zhenzhen，Liu Yang，et al.Generation，characterization，and potential therapeutic applications of cardiomyocytes from various stem cells［J］.Stem Cells Dev，2012，21(12):2095－2110.

［2］Willems E，Lanier M，Forte E，et al.A chemical biology approach to myocardial regeneration［J］.J Cardiovasc Transl Res，2011，4(3):340－350.

［3］Wang Yibin.Mitogen－activated protein kinases in heart development and diseases［J］.Circulation，2007，116(12):1413－1423.

［4］Hao Jijun，Daleo M A，Murphy C K，et al.Dorsomorphin，a selective small molecule inhibitor of BMP signaling，promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells［J］.PLoS One，2008，3(8):e2904.

［5］Lian Xiaojun，Hsiao C，Wilson G，et al.Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(27):E1848－E1857.

［6］Minami I，Yamada K，Otsuji T G，et al.A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined，cytokine－and xeno－free conditions［J］.Cell reports，2012，2(5):1448－1460.

［7］Aouadi M，Bost F，Caron L，et al.p38 mitogen－activated protein kinase activity commits embryonic stem cells to either neurogenesis or cardiomyogenesis［J］.Stem Cells，2006，24(5):1399－1406.

［8］Wu Jinzhan，Kubota J，Hirayama J，et al.p38 mitogen－activated protein kinase controls a switch between cardiomyocyte and neuronal commitment of murine embryonic stem cells by activating myocyte enhancer factor 2C－dependent bone morphogenetic protein 2 transcription［J］.Stem Cells Dev，2010，19(11):1723－1734.

［9］Barruet E，Hadadeh O，Peiretti F，et al.p38 mitogen activated protein kinase controls two successive－steps during the early mesodermal commitment of embryonic stem cells［J］.Stem Cells Dev，2011，20(7):1233－1246.

［10］Hadjal Y，Hadadeh O，Yazidi C E，et al.A p38MAPK－p53 cascade regulates mesodermal differentiation and neurogenesis of embryonic stem cells［J］.Cell Death Dis，2013，4:e737.

［11］Yan Lihui，Jia Zhuqing，Cui Jingjing，et al.Beta－adrenergic signals regulate cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells via mitogenactivated protein kinase pathways［J］.Dev Growth Differ，2011，53(6):772－779.

［12］Wu Liyuan，Jia Zhuqing，Yan Lihui，et al.Angiotensin II promotes cardiac differentiation of embryonic stem cells via angiotensin type 1 receptor［J］.Differentiation，2013，86(1/2):23－29.

［13］Graichen R，Xu Xiuqin，Braam S R，et al.Enhanced cardiomyogenesis of human embryonic stem cells by a small molecular inhibitor of p38 MAPK［J］.Differentiation，2008，76(4):357－370.

［14］Gaur M，Ritner C，Sievers R，et al.Timed inhibition of p38MAPK directs accelerated differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes［J］.Cytotherapy，2010，12(6):807－817.

［15］田龍，高航.P38MAPK信號通路在骨形態發生蛋白2誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2013，21(1):37－42.

(責任編輯 薛 榮)

The effect of p38 cascade in the early differentiation of P19CL6 cells towards cardiomyocytes

HUANG Qiaoli1， LI Tao1， JIANG Kesheng1， LIU Yinan2， LI Xianhui3， LIU Yuanwei4

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Department of Cell Biology，Health Sciences Center，Peking University，Beijing 100191，China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China;4.Department of Cardiology，Zhejiang Hospital，Hangzhou Zhejiang 310013，China)

It was estimated the effect of p38 cascade in the early stage of cardiac differentiation using P19CL6 mouse pluripotent carcinoma stem cells.In the presence of DMSO，P19CL6 cells were successfully induced to differentiate into spontaneously contracting cardiomyocytes characterized by the expression of cardiac－specific genes.It was observed the activation of p38 cascade during the differentiation process.Treatment with a high concentration of SB203580，a specific inhibitor of p38 kinase，significantly induced apoptosis of P19CL6 cells.Meanwhile，SB203580 at a low concentration greatly hampered the expression of cardiac marker genes GATA4 and Nkx2.5，and decreased the expression of cardiac differentiation－promoting factors such as BMP2 and BMP4.Additionally，overexpression of p38 α plasmids facilitated the expression of GATA4 and Nkx2.5.Taken these together，these results indicated that p38 cascade exerted a positive effect on the early differentia－tion of P19CL6 cells，and played an important role in maintaining cell growth and survival.

P19CL6 cells;cardiac differentiation;p38 kinase;signaling pathway

Q254

A

1001－5051(2015)01－0095－08

?:2014－03－11;

2014－06－27

國家自然科學基金資助項目(31101057;31470082);浙江省自然科學基金資助項目(LY14C120001)

黃巧麗(1990－)，女，浙江嵊州人，碩士研究生.研究方向:分子發育生物學.

李 濤.E－mail:litao@zjnu.cn

10.16218/j.issn.1001－5051.2015.01.016