HPLC手性固定相法拆分YNC光學異構體

尹文龍　郝英魁　全紅娜　潘雁濤　蔣慶峰

[摘 要] 目的：建立YNC 3個異構體的HPLC拆分法。方法：采用CHIRALPAK AD-H柱（4.6×250 mm，5 μm），以正己烷-異丙醇（82：18）為流動相，檢測波長232 nm。結果與結論：在選定色譜條件下YNC與其3個異構體完全分離，可用于本品的質量控制。

[關鍵詞] YNC；異構體；高效液相色譜；手性固定相

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2015）02-061-03

YNC是一種新型選擇性膽固醇吸收抑制劑，有調節血脂功效，目前國內尚無廠家生產。YNC結構中有3個手性中心，理論存在多個光學異構體，然而臨床以單一構型給藥。為了確保用藥安全，控制YNC異構體雜質限度具有重要意義。

本文建立了對YNC其中3個異構體HPLC拆分法，此方法靈敏度高，重復性好，為YNC進一步質量研究提供可靠分析方法及理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters E2695高效液相色譜儀（2489型檢測器，美國Waters公司）；Empower3色譜軟件（美國Waters公司）。

1.2 試劑

正己烷、異丙醇、乙醇（色譜級，Fisher Scientific）；Milli-Q超純水；YNC供試品（天津藥物研究院，批號：1401，1402，1403）；YNC1、YNC2、YNC3異構體對照品（天津藥物研究院）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CHIRALPAK AD-H （4.6×250 mm，

5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇（80：20）；檢測波長232 nm；流速：1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量

20 μL。

2.2 溶液配制

精密稱取YNC 20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，各取1 mL至100 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）稀釋至刻度，濃度為 20.00μg/mL，作為YNC儲備液，同法分別配置YNC1、YNC2、YNC3異構體儲備液，各異構體儲備液最終濃度依次為YNC1 20.3 μg/mL、YNC2為21.0 μg/mL、YNC3為 22.0 μg/mL。

2.3 專屬性

2.3.1 精密稱YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容。按“2.1”項下色譜條件，進樣分析，記錄色譜圖。同法進樣YNC1、YNC2、YNC3異構體儲備液，各樣品保留時間為YNC：20.001min；YNC1：14.332min；YNC2：21.830min；YNC3：25.695min。

2.3.2 加熱破壞 精密稱取YNC供試品100 mg至50 mL燒瓶中，加10 mL異丙醇溶解，正己烷-異丙醇（80：20）定容至刻度，于80 ℃水浴回流加熱0.5 h，放至室溫。按“2.1”項下色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖，同法以異丙醇作為加熱試驗空白對照。

2.3.3 光照破壞 精密稱取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，于光照室（光照強度4500xl）放置一天，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖，同法以正己烷-異丙醇（80：20）作為光照試驗空白對照。

結果表明，在上述條件下均有不同程度降解，并且各破壞條件下降解產物均與主峰達到良好分離，說明本法專屬性較強。

2.4 系統適應性實驗

分別稱取YNC、YNC1、YNC2、YNC3適量，用正己烷-異丙醇（80：20）溶解并稀釋制成每mL約含YNC為2μg，YNC1、YNC2、YNC3約為0.5μg溶液，即為系統適應性溶液。按“2.1”項下色譜條件，連續進樣5針系統適應性溶液，記錄色譜圖，見圖1。

1.YNC1；2.YNC；3.YNC2；4.YNC3

上述色譜條件下分析，理論板數以YNC和其異構體計均大于3000，YNC峰及其異構體與相鄰色譜峰間分離度大于1.5，拖尾因子符合要求，如表1所示。

2.5 檢測限與定量限

按“2.1”項下色譜條件，分別將YNC、YNC1、YNC2、YNC3儲備液適當稀釋至信噪比（S/N）10倍作為定量限，測得YNC定量限濃度為0.320 μg/mL、YNC1為0.324 μg/mL、YNC2為0.210 μg/mL、YNC3為0.308 μg/mL；稀釋至信噪比（S/N）3倍作為檢測限，測得YNC為0.0960μg/mL檢測限濃度為YNC1為 0.0972μg/mL、YNC2為0.0630 μg/mL、YNC3為0.0924 μg/mL。

2.6 線性

精密量取YNC儲備液各0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、2.0 mL至10 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，并取其定量限溶液，即為各濃度線性溶液。同法配置YNC1、YNC2、YNC3各線性溶液。按“2.1”項下色譜條件，每濃度進樣3針，記錄色譜圖。

以濃度（μg/mL）為橫坐標，以3針峰面積平均值為縱坐標，進行線性回歸，結果見表2。

結果表明YNC1、YNC2、YNC3對照品在各自測定濃度范圍內線性關系良好。

2.7 重復性

精密稱6份YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容。按“2.1”項下色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖。按“2.1.”項下：總雜質峰面積和YNC主峰面積計算得主峰峰面積RSD為1.49% 總雜質RSD為1.44%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性

精密稱取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，室溫放置，在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按“2. 1”項下色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖。按總雜質峰面積和YNC主峰面積計算得主峰峰面積RSD為1.20% 總雜質RSD為3.25%，表明本品在24h內基本穩定。

2.9 回收率

精密稱9份批YNC 20 mg至10 mL容量瓶中，每份加2 mL異丙醇溶解，然后每3份為1組，依次加入YNC1、YNC2、YNC3儲備液各0.8 mL、1.0 mL、1. 2 mL至3組容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，即得9份回收液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖。

上述色譜條件下分析，計算回收率，結果見表3。

結果顯示YNC1、YNC2、YNC3回收率均在90%～110%之間，符合要求。

2.10 耐用性實驗

分別考察了流速變化±0.1 mL/min、柱溫變化±3 ℃、檢測波長變化±3 nm、流動相比例變化±3%條件下系統適用性和有關物質含量變化，表明系統適用性均符合要求，異構體含量無明顯變化，表明方法耐用性良好。

2.11 校正因子測定

按線性測定方法計算得YNC對照品線性方程為Y=53515X-4851.9 R=0.9994。則YNC1、YNC2、YNC3校正因子分別為0.93、0.97、1.07。各異構體校正因子均在0.9～1.1之間，可按不加校正因子主成分自身對照法測定各異構體含量。

2.12 樣品異構體檢查

精密稱取YNC原料藥20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，配置成2 mg/mL YNC供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，作為對照溶液。取對照溶液按“2.1”項下色譜條件，分別進樣分析，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高為滿量程10%～20%。再按“2.1”項下色譜條件，取供試品溶液進樣分析，結果只檢出YNC2異構體，按不加校正因子主成分自身對照法計算，YNC1401、1402、1403批原料藥中異構體YNC2含量分別為0.07%、0.06%、0.07%；各批結果均小于0.1%，即小于對照溶液峰面積1/10，結果見表4。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

我們初步嘗試CHIRALPAK IA、AS-3、AD-H柱（規格均為4.6×250 mm，5 μm）對樣品進行分離考察，結果顯示，各異構體在IA柱下保留時間接近，分離度差；在AS-3柱中各異構體峰理論塔板數較低；AD-H柱能對其3個異構體實現分離，且分離效果良好，因此選擇AD-H。

3.2 流動相優化

考察了正己烷-乙醇、正己烷-異丙醇2個流動相體系，異構體定位試驗顯示，2個體系中各異構體出峰時間和出峰次序區別很大，由于正己烷-異丙醇體系中各峰理論塔板數明顯高于正己烷-乙醇體系，見表5。因此選用正己烷-異丙醇作為本試驗流動相體系。

4 結論

用HPLC法對手性藥物拆分主要有手性衍生化法，手性流動相添加劑法，手性固定相法，其中手性固定相法應用最為普遍。CHIRALPAK AD-H柱固定相為表面涂敷了手性多聚物[直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯氨基甲酸酯）]球形硅膠，對大多數異構體有極高手性能力。

本文采用CHIRALPAK AD-H柱成功拆分了YNC3個光學異構體，分離度良好。所建立靈敏度高，分析方法快速，適用于YNC原料藥中異構體雜質檢查。

參 考 文 獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：61.

[2] 手性藥物質量控制研究技術指導原則，國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心[S].北京，2006.

[3] 化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則，國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心[S].北京，2005.

[4] 鄒巧根，孫莉莉，韋 萍.HPLC 手性固定相法拆分恩替卡韋光學異構體[J].中國藥科大學學報，2012，43（1）：51-54.

[5] 潘端錦，沈衛陽，陳蓉. HPLC法檢測鹽酸度洛西汀中有關物質及對映異構體[J].海峽藥學，2010，22（5）：67-69.

[6] 李益振，李臣貴，胡育筑.HPLC法測定鹽酸吉西他濱含量及有關物質[J].海峽藥學，2010，22（6）：67-70.

[7] 謝安云，徐燕，蔣銀妹.高效液相色譜法測定恩替卡韋分散片全反式異構體[J].醫藥導報，2010，29 （5）：653-654.

[8] 李丹，李曉寧，李春紅.手性拆分左乙拉西坦原料藥中異構體[J].安徽醫藥， 2008， 12（12）： 1134-1135.

[9] 章璐幸，殷婷婕，沈衛陽，等.手性固定相HPLC法分離測定匹多莫德對映異構體[J].中國藥科大學學報，2011，42（3）：238-241.