碳納米管-辣根過氧化氫酶-聚氨基苯硼酸復合物制備過氧化氫生物傳感器

(懷化學院 化學與化學工程系，湖南 懷化 418008)

由于其可逆的相互作用，硼酸基化合物被廣泛地用于化學/生物傳感的識別單元，比如對含鄰位雙羥基的單糖[1-2]、多巴胺[3]、乳酸[4]、糖基化血紅蛋白[5]和糖蛋白識別[6].而許多糖蛋白包括酶都是含糖基蛋白，如葡萄糖氧化酶的羰基化程度達到16%～25%.因此，基于硼酸-二醇相互作用用于生物界面的識別勢必受到極大的關注[7-9].通過其單體的電化學[1，10]或化學聚合[11]，硼酸-二醇相互作用已經被有效地用于聚合自摻雜聚氨基苯硼酸.電化學聚合一般需在酸性條件下采用恒電位或循環伏安法來進行，但很難制備大量的聚合物.而化學聚合需采用相對較強的化學氧化劑，其氧化產物不能溶解于相應的溶劑中[12].因此，酶作為生物催化劑用于聚合物聚合引起了廣泛的關注[13-18].比如一些氧化還原酶，如HRP[19]、漆酶[20]、葡萄糖氧化酶(GOD)[21]、血紅蛋白[22]等均用于苯胺的水相聚合.

碳納米管(CNTS)由于其高的機械性能、彈性和獨特的電子特性而被賦予了廣泛的運用，比如基于碳納米管為模板對聚合物的合成.這些雜化材料表現出來的性質往往是不同于任何單一組分所表現出來的性質.因此，CNTS/聚合物復合材料在能源器件、微電化學系統、超級電容器、太陽能生物傳感器等方面得到改善其性能的作用[23-25].而導電聚合物往往成為了制備碳納米管/聚合物復合材料的首選，如聚吡咯、聚噻吩和聚苯胺[26-28].聚苯胺不僅能在空氣和許多溶劑中穩定存在，還能在質子摻雜的條件下表現出獨特的電子結構和物理性能.

基于PABA 優良的生物相容性和特異性識別及CNTS 優良的導電性，以典型糖蛋白酶(HRP)為生物催化試劑，通過一步酶催化作用制備了MWCNTs-HRP-PABA 復合物材料，并用于過氧化氫的生物傳感的構建.過氧化氫的直接電化學及對H2O2電化學催化性能實驗表明，通過酶催化一步制備方法來固定糖蛋白酶能為酶提供了一個生物相容的微環境.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

MWCNTs 購自nanoports 有限公司 (中國深圳)，直徑為20～40 nm，長度5～15 nm.使用前，將用3∶1的濃硝酸和濃硫酸混合配置的溶液處理，80℃反應24 h 引入羧酸基團，然后分散在水溶液中，用水沖洗到中性pH值，60℃下干燥.

HRP (250 U·mg-1，國藥化學試劑有限公司)，氨基苯硼酸一水合物(ABA，邵圓化工科技有限公司，上海)，30%的過氧化氫溶液(上海桃浦化工廠)，過氧化氫溶液的制備要現配現用.0.1 M 磷酸鹽緩沖液(PBS)作為支持電解質.其它試劑均為分析純.所有試劑采用雙蒸餾水制備.實驗均在室溫20℃左右進行.

電化學實驗在CHI660C 電化學工作站進行(CHI儀器有限公司，上海辰華)由CHI660C 軟件控制.電化學實驗采用玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，碳棒為對電極的三電極系統.紫外-可見吸收光譜用UV2450 分光光度計(島津有限公司，日本).PHS-3C pH 計(上海雷磁SCI 儀器公司).掃描電化學顯微鏡SEM (S4800，日本日立).

1.2 MWCNTs-HRP-PABA 復合材料的制備

MWCNTs-HRP-PABA 復合材料合成如下:1 mg純化的MWCNTs 超聲分散于10 mL 0.1 M PBS 溶液，然后加入10mg ABA 充分溶解.加入2 mg HRP，不斷攪拌1 h.為了避免由于過量的過氧化物酶的抑制，用0.3%的H2O2溶液逐滴加入，混合物反應攪拌1 h 后，直到一種黑色的MWCNTs-HRP-PABA 復合物從溶液中沉淀出來.未反應的單體經透析分離12 h 從溶液中除去.

1.3 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極的制備

將玻璃碳電極(GCE，直徑3 mm)清洗干凈.將5 μL 1 mg/mL MWCNTs-HRP-PABA 溶液滴于GCE表面.放入冰箱中自然干燥得到所需電極.

2 結果與討論

2.1 聚氨基苯硼酸的酶促聚合

用HRP作為生物催化劑，當H2O2作為溫和的氧化劑加入到單體溶液，溶液的顏色沒有改變，表明ABA的氧化和聚合發生的很緩慢.而在HRP 添加后顏色很快變成墨綠色，隨著時間的推移顏色完全變黑，離心得到復合物材料.

ABA 氧化聚合的紫外可見光譜如圖1所示.吸光度與酶促聚合在450 nm 附近極化子吸收帶隨H2O2的加入顯著增加，這可能是由于低聚物的合成伴隨醌和苯環之間轉換誘導.在292 nm 處有一個明顯的吸收峰，且曲線1～11的紫外吸收峰值迅速增大，這是由于ABA 單體發生了快速的氧化還原反應，ABA 聚合生成PABA，紫外光譜的峰值明顯增大.

圖1 ABA，PABA-HRP 復合物的紫外-可見吸收光譜圖

曲線1為ABA，曲線2～11為不同反應時間的PABA/HRP 復合物

2.2 掃描電子顯微鏡(SEM)

利用SEM技術表征了MWCNTs 及MWCNTs-PABA 修飾電極的表面形貌.圖 (2A)為單一MWCNTs，其形狀為彎曲帶狀并相互交錯盤結.聚合物修飾后，帶狀直徑明顯增大，表明PABA 完全覆蓋到了MWCNTs 上，如圖(2B)所示.

圖2 MWCNTs 及MWCNTs-PABA的SEM 圖

2.3 MWCNTs-PABA的電化學表征

圖3是MWCNTs和MWCNTs-PABA 修飾電極在0.2 M H2SO4溶液中的循環伏安曲線.MWCNTs-PABA修飾的電極 (曲線b)含有兩對氧化還原峰，而MWCNTs 修飾電極沒有明顯的氧化還原峰(曲線a)，這是典型的聚苯胺的氧化還原峰，這表明ABA 已被成功固定在MWCNTs 上.

圖3 MWCNTs (a)和MWCNTs-PABA (b)修飾電極在0.2 M H2SO4 中的循環伏安曲線圖

2.4 修飾電極的電化學特性

圖4 MWCNTs (a)與MWCNTs-HRP-PABA (b)修飾電極在0.1 M PBS (N2 氛)中的循環伏安圖

修飾電極在0.1 M PBS 溶液中-0.6～0 V的電位范圍內掃描得到的CVs (圖4).與MWCNTs 修飾電極相比，MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在-0.35 V 處出現了一對氧化還原峰(b)，這是HRP和底層電極之間發生直接電子轉移的結果.結果表明，HRP 已被成功地固定在納米復合材料上且電化學活性保存良好.

修飾電極電流響應隨掃描速率的增大而迅速增大，但峰電位基本保持不變(圖5).峰電流Ipa和Ipc與掃速速率的平方根成線性關系，其回歸方程是:Ipc(μA)=3.0440+0.3773 v (mV·s-1) (R2=0.9983)和Ipc(μA) =-11.043-0.4252 v (mV·s-1) (R2=0.9985)，這表明電極表面發生的電化學反應是受擴散控制的可逆電化學過程.

圖5 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在PBS 中在不同掃描速率時的循環伏安圖

圖6 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在加入0 mM H2O2(曲線a)和0.5 mM H2O2 (曲線b)的循環伏安圖

過氧化氫生物傳感器在空白和含過氧化氫的PBS(pH 7.0)溶液中的循環伏安曲線如圖6.在空白的PBS 溶液中，在-0.25 V/-0.35 V 出現一對氧化還原峰，這歸屬于聚苯胺的氧化還原峰.加入過氧化氫后，這對氧化還原峰發生了明顯的變化，氧化峰明顯減小，而還原峰明顯增大，這是典型的催化行為.

2.5 實驗參數優化

pH條件優化表明在pH 7條件下傳感器的響應最大(如圖7A)，因此我們實驗的條件選擇在pH 7的條件下進行.另外我們也考察了電位對傳感器的響應的影響，結果表明在-0.25 V 時可以得到最高的靈敏度(如圖7B).

圖7 pH值對H2O2 傳感器的影響(A)及響應電流與外加電壓的關系(B)

2.6 過氧化氫生物傳感器的電流響應

如圖8所示，在施加電壓為-0.25 V時，MWCNTs-HRP-PABA 修飾玻碳電極在加入不同濃度的過氧化氫時發生典型的安培電流響應.結果表明:過氧化氫在20 μM～1.21 mM之間生物傳感器的電流響應與過氧化氫的濃度成線性關系，線性方程為:ΔI(μA) =-5.390 ×10-3+5.405 c(R2=0.9973)，檢測限為5 μM (S/N=3).隨著過氧化氫濃度的增加，通過電流逐漸增大，結果表明修飾電極上固定的酶保持了良好的生物活性.

圖8 MWCNTs－HRP－PABA 修飾電極對H2O2 響應的I － t 曲線圖

2.7 重復性，穩定性的干擾測定

為了考查傳感器的穩定性，使用同批次購置的9支酶電極響應相同量的H2O2，其響應電流幾乎不變，展現了良好的制備和檢測重復性，相對標準偏差(RSD)為1.8%.生物傳感器的長期穩定性是評價性能的重要參數，該修飾電極對H2O2的催化氧化穩定性進行了研究，被保存在4℃環境2 周后，電流信號下降小于5.1%，表明該修飾電極具有良好的穩定性.

3 結論

基于酶催化和硼酸特異性識別成功地制備了MWCNTs-HRP-PABA 復合材料，并建立了一種新穎的過氧化氫生物傳感器.相比已報道的過氧化氫生物傳感器而言，該傳感器表現出響應快，靈敏度高，其檢測下限為5 M.筆者認為主要有兩個原因所引起:第一，該復合物提高了酶的活性中心到電極表面更加便利的傳導路徑和提供了保持酶活性理想的微環境，特別是硼酸能可逆地與1，2-或1，3 鄰二醇化合物成鍵更是有利于保持酶的活性;第二，這種酶催化苯胺聚合的方法更有利于對H2O2催化，提高靈敏度.總之，這種酶催化合成的生物膜為發展一種高靈敏的電化學生物傳感器提供了一種可能.

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