HPLC法測(cè)定清肺抑火片中梔子苷、大黃素、大黃酚的含量

趙子劍，殷望宇

(懷化學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系， 湖南 懷化 418008)

清肺抑火片是由明代龔延賢《壽世保元》中清肺抑火湯加減而制成的中成藥，方由黃芩、梔子、黃柏、大黃、苦參、天花粉、知母、桔梗和前胡九味藥組成，是臨床療效確切的咳嗽、發(fā)熱、便秘治療藥［1］.目前清肺抑火片的質(zhì)量控制研究雖已取得不少可喜成果，但仍存在缺點(diǎn)［2－8］，例如，質(zhì)量控制僅有制劑通則項(xiàng)下檢測(cè)內(nèi)容，標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單或不能同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分，導(dǎo)致定量耗時(shí)且不經(jīng)濟(jì).為了有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文用HPLC 法同時(shí)測(cè)定了方中梔子苷、大黃素和大黃酚的含量.現(xiàn)報(bào)道如下:

1 儀器、試藥

1.1 儀器

CBL9960A 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀有限公司);METTLER TOLEDOAG135 型電子分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);FW 型中藥粉碎機(jī);LC－15C 高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，Lcsolution 色譜工作站(日本島津)等.

1.2 試藥

清肺抑火片(批號(hào)53020994、53020995、53020996，0.6 g/片)由云南省曲靖藥業(yè)有限公司提供;梔子苷對(duì)照品(批號(hào)110749－201115)，大黃素對(duì)照品(批號(hào)110756－200110)，大黃酚對(duì)照品(批號(hào)110796－200514)，以上對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;方中9 味藥材購(gòu)于懷化市懷仁大藥房;甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純.

2 含量測(cè)定

2.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流量:1.0 mL/min，流動(dòng)相為乙腈 (A)－0.1% 磷酸水溶液 (B)，梯度程序:0 ～15 min，15%A;15 ～20 min，15% ～25%A;20 ～25 min，25%～35% A;25 ～30 min，35% ～55% A;30 ～35 min，55% ～75% A;35 ～40 min，75% ～90% A;40 ～70 min，90%A.檢測(cè)波長(zhǎng)分別為238 nm (梔子苷)和254 nm (大黃素，大黃酚)［9］.

2.2 對(duì)照品溶液的制備［9］精密稱(chēng)取五氧化二磷減壓干燥12 h 后的梔子苷、大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含梔子苷30 μg、大黃素和大黃酚40 μg 的溶液，搖勻，即得梔子苷、大黃素和大黃酚對(duì)照品溶液.

2.3 供試品溶液的制備［10－11］取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.1 g，精密稱(chēng)取，置于100 mL 容量瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò).精密量取續(xù)濾液10 mL，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得清肺抑火片供試品溶液.

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺梔子，大黃藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液.

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取各對(duì)照品溶液，清肺抑火片供試品溶液，缺梔子，大黃的陰性樣品供試液各20 μl，注入HPLC 儀，按“2.1 色譜條件”測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1 可知，供試品與對(duì)照品色譜在相近的保留時(shí)間內(nèi)(梔子苷tR=9.7 min，大黃素tR=52.8 min，大黃酚tR=61.9 min)有相似的色譜峰而陰性樣品無(wú)這些色譜峰，且樣品中梔子苷、大黃素、大黃酚與其他色譜峰均可達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，測(cè)定結(jié)果表明陰性樣品無(wú)干擾.

圖1 HPLC 色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述梔子苷對(duì)照品溶液(30 μg/mL)，分別取2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸.得梔子苷線性回歸方程為y = 2 × 106x－5258.7，R2=0.9994;表明梔子苷在0.06 ～0.6 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.精密吸取上述大黃素、大黃酚對(duì)照品溶液(40 μg/mL)，分別取2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸.得大黃素線性回歸方程為y = 3 × 106x +140008，R2=0.9998;大黃酚線性回歸方程為y = 5 ×106x +23958，R2=0.9999;表明大黃酸、大黃素在0.08 ～0.8 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件操作，重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣20 μl，測(cè)定其峰面積，算出RSD.結(jié)果梔子苷峰面積的RSD 為1.04%，大黃素和大黃酚峰面積的RSD 分別為0.16%和0.88%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法精密度良好.

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h 時(shí)進(jìn)樣，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD 為1.12%，大黃素峰面積的RSD值為0.49%，大黃酚峰面積的RSD 值為0.38%.表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6 份，按上述供試品溶液制備方法，平行制樣并測(cè)定，結(jié)果測(cè)得供試品中梔子苷平均含量為0.61905 mg/g，RSD =1.32% (n=6);大黃素平均含量為0.4308 mg/g，RSD =1.10%(n = 6);大黃酚平均含量為0.4860 mg/g，RSD =0.41% (n=6).說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好.

2.10 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知濃度的供試品0.25 g，置于具塞錐形瓶中.平行稱(chēng)定6 份.在6 份樣品中分別精密加入梔子苷、大黃素、大黃酚對(duì)照品適量(相當(dāng)于樣品中這些成分含量的80%、100%、120%)，然后加甲醇60 mL，超聲40 min.按上述色譜條件操作，測(cè)定這6 份供試品溶液中梔子苷、大黃素和大黃酚的含量，計(jì)算平均回收率及RSD 值.結(jié)果梔子苷的平均回收率為98.33%，RSD 為0.55%;大黃素平均回收率為97.43%，RSD 為0.50%;大黃酚平均回收率為97.73%，RSD 為0.87%.結(jié)果表明，本方法回收率良好.

2.11 樣品測(cè)定 按上述樣品溶液制備方法及色譜條件，測(cè)定3 份清肺抑火片樣品，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 樣品中梔子苷、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定

3 討論

本文用HPLC 法一次測(cè)定了清肺抑火片中梔子苷、大黃素、大黃酚的含量.該方法供試品溶液制備簡(jiǎn)便易行，專(zhuān)屬性好，分離度符合要求，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可作為該制劑含量測(cè)定的方法.

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還考察了0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 等多種流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為1.0 mL/min 的時(shí)候，樣品中目標(biāo)成分的分離效果較好，各組分的分離度均能達(dá)到1.5 以上.在流動(dòng)相選擇的實(shí)驗(yàn)中，筆者比較了乙腈－0.1%磷酸溶液，甲醇－0.1%磷酸溶液，乙腈－水3 種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈－0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)各組分分離效果較好，基線較平穩(wěn).

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