鴨兒芹體外抗氧化作用研究

文 婷，阮 潔，皮建輝，3，譚 娟，3

(1.懷化學院 生命科學系，湖南 懷化 418008;2.貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550001;3.懷化學院 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008)

活性氧(ROS)自由基是機體正常代謝過程中產生的中間產物，在生物體衰老與疾病以及正常的免疫、代謝與細胞信號傳導等過程中都有著重要的生理作用[1].當機體內自由基過多時會造成DNA、蛋白質和脂質膜的破壞[2]，從而導致癌癥、動脈硬化、衰老和多種疾病[3，4]的發生，因此尋找能夠清除自由基的抗氧化劑，研究其抗氧化活性與機理顯得十分重要.鴨兒芹(Cryptotaenia japonica Hassk)別名三葉芹、鴨腳板，屬傘形科鴨兒芹屬多年生的藥食兩用草本植物，富含多種維生素、礦物質及生物活性成分，通常生于海拔200～2 400 m的山地、山溝及林下較陰濕的地區，研究發現鴨兒芹具有抗氧化、抗癌癥、保肝護肝、降血脂等作用[5]，本項目通過筋骨草體外抗氧化作用研究，進一步探討筋骨草的保健功能.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采集新鮮的鴨兒芹清洗干凈并放在陰涼處使其風干.將干燥的鴨兒芹植株粉碎過100目篩，取粉末40 g 用80℃蒸餾水800 mL 浸提3小時，重復三次.將浸提液過濾后旋轉蒸發濃縮，將濃縮液真空干燥得鴨兒芹水提取物粉末，密封于-20℃冰箱備用.

試驗動物為三月齡KM 小鼠，購自中南大學實驗動物中心，許可證號:SCXK (湘)2010-0001.小鼠禁食過夜后脫頸椎處死，迅速取出肝臟，置于預冷生理鹽水中沖洗后，冰上研磨制成5%組織勻漿.

DPPH (北京中生瑞泰);鄰二氮菲(天津恒興);自由基測試盒(南京建成);三氯乙酸、硫代巴比妥酸(上海宏瑞);其他試劑均為湖南化工研究所產品.

主要儀器:DU800 紫外P可見分光光度計(美國Beckman公司)、OSB-2000、DTC-21旋轉蒸發儀(美國)、FD-1C 冷凍真空干燥機 (北京德天佑公司)、FW177 材料粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(武漢琴臺醫療器械廠).

1.2 方法

1.2.1 鴨兒芹對DPPH 自由基的清除

分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液1 mL，加入0.05 mg/mL DPPH 無水乙醇溶液2 mL，混合后避光靜置30 min，然后于517 nm 處測量吸光值(At)，同時測定等體積無水乙醇和對應梯度濃度樣品的混合液吸光值(Aj)、等體積無水乙醇和DPPH 溶液混合液的吸光值(Ai)和等體積無水乙醇的吸光值(A0)，計算DPPH·自由基清除率(%) =[1-(At-Aj)/(Ai-A0)]×100.

分別配制鴨兒芹提取物樣品梯度濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL，采用南京建成生物工程研究所的抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測試盒檢測.試驗按照說明進行，采用蒸餾水作空白，計算O-2·自由基清除率 (%)=[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除

分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液1 mL，加入0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液2.0 mL、0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL、0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1.0 mL，最后加入2%過氧化氫1 mL，混勻后放置30 min.空白是以蒸餾水代替樣品溶液，對照組是以蒸餾水代樣品和硫酸亞鐵，于波長520 nm 處測吸光度值，計算·OH 自由基的清除率(%) =[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.4 鴨兒芹對小鼠肝臟自發性脂質過氧化的抑制

分別配制濃度為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液0.5 mL (對照管用生理鹽水代替)，加入現制的5%肝臟組織勻漿1.5 mL，混勻后37℃水浴中震蕩溫育120 min后，再加入1.5 mL 20%三氯乙酸終止反應，3 500 rpm離心10 min，取上清液2.0 mL.各上清液加入1.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，95℃水浴15 min 顯色后取出冷卻至室溫，測定其在532 nm 處的吸光值，計算MDA生成抑制率(%) =[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導肝臟線粒體氧化損傷的抑制

制備肝臟線粒體懸浮液[6].分別取濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液0.4 mL (空白管、對照管用生理鹽水代替)，向各樣品溶液中加入1.0 mL 線粒體懸浮液.其中樣品管、對照管同時再加入0.4 mL 硫酸亞鐵溶液(0.5 mmol/L)和0.4 mL VitC 溶液(0.5 mmol/L)，空白管加入0.8 mL 生理鹽水.振蕩混勻后于37℃溫育30 min，測其在520 nm 處吸光值，并計算線粒體腫脹度(%) =[(A0-At)/A0]×100%.其中A0、At分別是空白管和樣品管或對照管的吸光值.

2 結果

2.1 鴨兒芹對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色并在517 nm 處有最大吸收峰.自由基清除劑可使其顏色變淺，所以可通過吸光值的降低來反映自由基清除劑樣品對DPPH·的清除能力.圖1顯示，鴨兒芹提取物對DPPH·自由基的清除作用具有明顯的量效關系，其IC50為5.48 mg/mL，且當提取物濃度達到9 mg/mL 時，其對DPPH·自由基的清除率達到最大85.4%.

圖1 鴨兒芹對DPPH·自由基的清除作用

2.2 鴨兒芹對·自由基的清除作用

2.3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除作用

圖2 鴨兒芹對O -2·自由基的清除作用

·OH 自由基的氧化性質十分活躍，對機體的生物膜等具有極強的破壞性，具有作用最強、毒性最大等特點.圖3顯示，鴨兒芹提取物對·OH 自由基的清除作用較強，一定濃度范圍內呈現明顯的量效關系，其IC50為2.78 mg/mL，特別是在鴨兒芹提取物質量濃度2.0～5.0 mg/mL之間，清除率增加極明顯，當鴨兒芹提取物質量濃度為6 mg/mL，其對·OH 自由基的清除率達到最大94.2%.

圖3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除作用

2.4 鴨兒芹對肝細胞膜自發脂質過氧化的抑制作用

鴨兒芹提取物對小鼠肝臟自發脂質過氧化反應的抑制作用如圖4，顯示一定濃度范圍內，鴨兒芹提取物對小鼠肝臟自發脂質過氧化的抑制作用呈現出明顯的量效關系，其IC50為2.86 mg/mL.當鴨兒芹提取物質量濃度達到4.5 mg/mL 時，抑制率已接近最大抑制率86.8%.

圖4 鴨兒芹對肝細胞膜自發脂質過氧化的抑制作用

2.5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導的肝臟線粒體氧化損傷的抑制作用

表1和圖5顯示，鴨兒芹提取物能抑制Fe2+-VitC 誘導肝線粒體氧化損傷.隨著鴨兒芹提取物質量濃度的增加，反應體系的吸光值OD520nm遞增，線粒體氧化損傷所致腫脹度明顯下降，并呈現顯著的量效關系.當鴨兒芹提取物質量濃度達到5.0 mg/mL 時，鴨兒芹提取物抗小鼠肝臟線粒體氧化損傷接近最佳效果

圖5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導的肝臟線粒體氧化損傷的抑制作用

3 討論

自由基是游離存在的具有非偶電子的基團或原子，在體內有很強的氧化反應能力，易對蛋白質、脂質和核酸等產生傷害，從而引起機體損傷[7].人類食物中有多種抗氧化物質，它們能夠清除自由基，并能以消除過氧化氫、清除超氧陰離子和單態氧的方式抑制自由基的形成[8].鴨兒芹含有豐富的揮發性成分與其他生物活性物質[9]，本研究結果表明鴨兒芹提取物對DPPH·、·、·OH 這3種自由基均表現出顯著的清除效果，其最大清除率分別達到85.4%、82.4%和94.2%，其IC50分別為5.48、4.23和2.78 mg/mL，表明鴨兒芹提取物具有較強的清除自由基的活性功能，特別是對·OH的清除能力尤為突出.

生物膜的完整性是細胞維持正常生理功能的必要條件，然而生物膜脂質過氧化作用能氧化分解膜中多元不飽和脂肪酸而產生MDA，從而使膜的通透性增大，影響膜的正常生理功能[10-11].本研究結果表明，鴨兒芹提取物能明顯抑制體外生物膜脂質過氧化作用，在一定范圍內呈現明顯的量效關系.鴨兒芹提取物的對生物膜脂質過氧化反應的抑制作用不但表現在生物膜的自發性脂質過氧化，而且還表現在由Fe2+-VitC誘導的肝臟線粒體膜的脂質過氧化，表明鴨兒芹提取物對生物膜的脂質過氧化具有廣泛的抑制作用.

通過鴨兒芹提取物的體外抗氧化作用研究，表明鴨兒芹是一種良好的天然抗氧化劑的優勢資源，也為進一步研究其體內生理活性提供了理論基礎.

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