昆蟲病原線蟲對黃地老虎致病力的研究

張安邦，南宮自艷，宋 萍，王勤英

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071000)

黃地老虎Agrotis segetum(Denis et Schiffermuller)屬鱗翅目Lepidoptera 夜蛾科Noctuidae，廣泛分布于全國各地，在我國每年發生2-4 代，食性很雜，是玉米、棉花、草坪和多種蔬菜的主要地下害蟲。第一代幼蟲于5月下旬至6月上旬進入為害盛期，是一年中為害最重的一代。黃地老虎幼蟲共6 齡，3 齡之前一般在寄主植物新葉等幼嫩部位晝夜取食，危害不大，但是3 齡以后幼蟲白天潛伏在被害作物或雜草根部附近的淺土層中，夜晚出來取食為害，將幼苗近地面的莖部咬斷，使整株死亡，并可轉株危害，每夜可咬斷3-5 株，多達10 株幼苗，造成缺苗斷壟(陳婧等，2013)。黃地老虎4 齡以上的幼蟲不僅食量大，危害嚴重，而且因為生活在土壤中，只取食貼近土表的根莖部分，所以極難防治。

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes，EPN)以感染期蟲態(infective juveniles，IJs)廣泛存在于土壤中，具有寄主范圍廣泛、可主動搜尋害蟲的特征，對一些化學農藥難以防治的隱蔽性地下害蟲和鉆蛀類害蟲尤為有效。昆蟲病原線蟲可規?；囵B，生產成本低，對人畜、環境安全，自20 世紀以來，已成為發展起來的一種有潛能的生物防治因子，成功用于防治多種地下害蟲(李曉巍等，1995;孫瑞紅和李愛華，2004;許艷麗等，2008;雷利平等，2013)。國內外學者在利用昆蟲病原線蟲防治小地老虎、八字地老虎地老虎方面做了有益的研究和探索(趙奎軍等，1995;楊建全等，2000;張思佳等，2005;Ebssa et al.，2012;Yan et al.，2014)，但是利用昆蟲病原線蟲防治黃地老虎幼蟲的研究尚未見報道。為了探索昆蟲病原線蟲防治黃地老虎的可行性，本文測定了9個不同昆蟲病原線蟲中或品系對黃地老虎幼蟲室內的侵染力，并測定了格氏線蟲Steinernema glaseri ib(Sgib)對黃地老虎的田間防效。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試線蟲

供 試 線 蟲 Heterorhabditis indica LN2、H.bacteriophora HB8、H.sp HB-gy、Steinernema carpocapsae HB310、S.longicaudum CW105、H.bacteriophora H06、S.longicaudum CBZB、S.glaseri ib、S.feltiae sn 均來自河北農業大學害蟲生物防治實驗室。選取的昆蟲病原線蟲在生測前均用大蠟螟進行活體擴繁，在10℃保存，保存時間不超過15 d(Malan et al.，2011)。

1.1.2 供試昆蟲

黃地老虎卵由中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室提供，在河北農業大學害蟲生防實驗室在溫度為26℃±1℃，濕度(≥70%)的黑暗培養箱中飼養。黃地老虎成蟲用10%的蜂蜜水飼喂;用棉鈴蟲的麥胚飼料(吳坤君，1985)將幼蟲在20 cm×17 cm×7 cm 養蟲盒內飼養至體長約3 齡后分裝于3 cm×8 cm 的指形管中，每管一頭(王偉等，2011)。

1.2 研究方法

1.2.1 不同昆蟲病原線蟲種類對黃地老虎致病力的測定

選取4 齡黃地老虎幼蟲(體重0.5209±0.09378 g)為供試昆蟲，測定9種侵染期昆蟲病原線蟲的侵染力。參照Malan(2011)等的方法，具體步驟如下:取直徑90 mm 培養皿，其內墊一張同等大小濾紙，每皿加入1 mL 的1000 IJs/mL線蟲懸浮液和4 頭黃地老虎幼蟲。每處理重復3 次，每重復20 頭供試幼蟲，以不含線蟲的滅菌水作為對照，將各處理放入溫度為25℃±1℃，相對濕度為80%左右的培養箱中。每隔24 h 檢查并記錄黃地老虎幼蟲死亡情況，直至120 h。

1.2.2 不同線蟲劑量對黃地老虎致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，在墊有一層濾紙的24 孔板中每孔放入一頭黃地老虎4 齡幼蟲，每孔加線蟲液40 μL，將篩選出的線蟲品系分別以與黃地老虎幼蟲數量比為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1，實驗條件、觀察方法同1.2.1。

1.2.3 不同溫度條件對線蟲致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，以黃地老虎4 齡幼蟲為試蟲，設計15℃、18℃、21℃、24℃、27℃和30℃共6個不同溫度條件，測定不同溫度對線蟲致病力的影響，其他實驗條件、觀察方法同1.2.1。

1.2.4 不同土壤濕度對線蟲致病力的影響

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，黃地老虎4 齡幼蟲為供試昆蟲，試驗設計5%、10%、15%和20%共4個不同含水量的細沙土。具體步驟如下:在直徑3 cm×高5 cm 的塑料盒中放入3 cm 的一定濕度的滅菌細沙土，然后將1 頭黃地老虎幼蟲放入塑料盒中，并在其上部放入人工飼料。每盒滴入100 μL 的1000 IJs/mL 線蟲懸浮液，同時設不加線蟲100 μL滅菌水作對照，每處理20 頭幼蟲，重復3 次，120 h后檢查并記錄黃地老虎幼蟲死亡情況。其他實驗條件、觀察方法同1.2.1。

1.2.5 線蟲田間防治效果的測定方法

以1.2.1 試驗部分篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲品系為研究對象，以黃地老虎4 齡幼蟲為供試昆蟲，試驗地選在河北農業大學試驗園內，每個小區面積10 m×20 m，內種植有玉米，試驗開始時間為2014年5月5日，玉米4 葉期，線蟲處理小區和清水對照小區各3個，間隔排列。具體步驟如下:每個實驗小區隨機放置內10個直徑11 cm、高8 cm的不銹鋼紗網籠子，籠內裝有土高約4 cm，將籠子埋入地下4 cm，使籠子內外土水平一致。每籠放入4 頭黃地老虎幼蟲。每處理重復3次，每重復40 頭黃地老虎幼蟲。在晚上7 點按667 m2施用1×109頭線蟲的劑量用噴霧器均勻噴施在試驗小區，噴完后立即澆地。對照處理同上，噴施不加線蟲的水。4 d 后取回并打開不銹鋼紗網籠子，觀察試蟲死亡情況及死亡狀態。

1.2.6 線蟲田間持效期的測定方法

在1.2.5 田間試驗后，每隔96 h 田間隨機取土5 點，每樣取土邊長20 cm×高5 cm 的長方體，混合均勻。將土裝入直徑11 cm×高6 cm 的塑料盒內，土高4 cm，放入10 頭5 齡大蠟螟，放于24℃培養箱中。每處理40 頭大蠟螟，重復3 次，以對照田中的土為對照組，120 h 后檢查并記錄大蠟螟幼蟲死亡情況。

1.3 數據分析

所有數據采用Duncan's 新復極差測驗法(New multiple range test，SSR)(DPS v7.05 軟件)單因素試驗統計分析進行統計處理分析。

校正死亡率(%)=［(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率］×100

2 結果與分析

2.1 不同昆蟲病原線蟲對黃地老虎幼蟲的致病力比較

由表1 明顯看出，9個不同昆蟲病原線蟲品系對黃地老虎幼蟲的致病力差異非常大，即使是同一屬不同種的線蟲，甚至同一種線蟲不同品系如HB8 和H06、CBZB 和CW105 對黃地老虎幼蟲的致死率也存在較大差異(df=8，18，F=11.289，P＜0.05)。從侵染后幾個時間段的試蟲死亡率綜合來看，在9種線蟲品系中，格氏線蟲Sgib 對黃地老虎幼蟲致死效果最好，侵染后24 h、48 h 和72 h 的校正死亡率就分別達到了28.33%、89.28% 和98.15%，均顯著高于其它線蟲品系。說明黃地老虎幼蟲對Sgib 最敏感，而S.feltiae sn和S.longicaudum CBZB 對黃地老虎幼蟲的致病力最低，幾乎不能侵染黃地老虎幼蟲。

表1 9種昆蟲病原線蟲對黃地老虎幼蟲的致病力Table 1 Pathogenicity of nine EPN species against Argotis segetum larvae

2.2 不同劑量的格氏線蟲Sgib 對黃地老虎幼蟲致病力的影響

對所篩選出的格氏線蟲Sgib，進一步測定不同線蟲劑量對該線蟲致病力的影響。從表2 可以看出，黃地老虎幼蟲的死亡率隨線蟲劑量的增加而上升。當線蟲與寄主數量比達到并超過10∶1 時，在侵染后各時間段不同數量比之間均沒有明顯差異(df=4，10，F=19.528，P＜0.05))。

2.3 不同溫度對格氏線蟲Sgib 致病力的影響

由表3 可以看出，處理后24 h-72 h，21℃-30℃溫度對Sgib 線蟲的致病力沒有明顯的影響，但是在18℃和15℃條件下，Sgib 線蟲的致病力顯著降低了。處理96 h 和120 h 時，當溫度為21℃-27℃時，Sgib 線蟲對黃地老虎幼蟲的致死率均在96%以上，不同溫度間差異不顯著，而當溫度低于21℃或超過27℃時，隨著溫度的升高或下降線蟲致病力不斷降低，差異也越來越顯著，在15℃時致死率僅為16.67%(df=5，12，F=11.289，P＜0.05)。由此可以看出，Sgib 對黃地老虎幼蟲最適宜的侵染溫度為21℃-27℃。

表2 不同數量格氏線蟲Sgib 對黃地老虎幼蟲的致病力Table 2 Pathogenicity of different dosages Sgib against Argotis segetum larvae

表3 不同溫度條件下格氏線蟲Sgib 的致病力Table 3 Pathogenicity of Sgib against Argotis segetum larvae at different temperature

2.4 不同土壤濕度對線蟲致病力的影響

在溫度為25±1℃的恒溫培養箱內測定了不同土壤濕度條件下格氏線蟲Sgib 對黃地老虎幼蟲致病力的影響(圖1)，可以看出，該線蟲對黃地老虎幼蟲的致死率隨著濕度的增加而遞增，濕度為15%時致死率為67%，土壤濕度為20%時，其致死率達到最大值100%。

2.5 格氏線蟲Sgib 田間防治效果

為了檢測格氏線蟲Sgib 的田間防效，按1×109頭線蟲/667m2的劑量在田間噴施侵染期格氏線蟲Sgib。由圖2 可以看出，田間噴施格氏線蟲Sgib后96 h 的供試黃地老虎幼蟲死亡率為96.67%，噴施清水對照組的黃地老虎幼蟲死亡率為1.67%，說明每667 m2使用1 億頭格氏線蟲Sgib 劑量，就可以有效控制田間的黃地老虎幼蟲。

2.6 線蟲田間持效期的測定結果

對格氏線蟲Sgib 侵染期線蟲在土壤中的持效期檢測結果表明(圖3)，田間噴施線蟲0 h 時格氏線蟲Sgib 對大蠟螟幼蟲的侵染率為100%，田間使用96 h 后對大蠟螟幼蟲的校正死亡率下降為55.83%，192h 后為14.17%，288h 后為8.33%，下降速度很快。對照組死亡率穩定在5.83%-7.50%，不同時間無顯著差異。

圖1 不同土壤濕度對格氏線蟲Sgib 致病力的影響Fig.1 Pathogenicity of Sgib to Argotis segetum larvae at different soil moisture

圖2 格氏線蟲Sgib 對黃地老虎幼蟲的田間防效Fig.2 Control effect of Sgib to Argotis segetum larvae in filed

圖3 格氏線蟲Sgib 田間持效期Fig.3 Persistence period of Sgib in field

3 結論與討論

昆蟲病原線蟲的寄主特異性較高，不同種、不同品系會對相同的宿主昆蟲產生不同的防治效果，相同的種或品系對不同的寄主防效也不相同，選擇適宜的線蟲種或品系是獲得成功防治的關鍵(Bedding and Miller，1981;Georgis and Gaugler，1991)。室內生物測定結果表明，本實驗供試的9種昆蟲病原線蟲對黃地老虎幼蟲的侵染力差別很大，其中格式線蟲Sgib 的致病力最高，在每個時間段對黃地老虎幼蟲的致死效果均高于其它線蟲品系。

土壤中昆蟲病原線蟲的基數對于控制害蟲的為害至關重要(劉樹森等，2010)。格氏線蟲Sgib不同數量對黃地老虎幼蟲的致病力測定結果表明，在相同侵染時間內，線蟲對寄主昆蟲的致病力隨線蟲濃度的增高而增高，但當線蟲數量與寄主數量比為10∶1 和50∶1 時，其侵染力結果無差異。根據24 孔板孔徑面積和大田面積之比，當線蟲與幼蟲數量比為10∶1 時，田間需使用0.3×109/667 m2?？紤]到田間土壤環境比較復雜，在田間施用時可以適當增加線蟲量。

溫度不僅影響昆蟲病原線蟲的存活、生長發育、繁殖、遷移活動、對寄主的侵染能力和致死速率(余向陽，2003;劉樹森等，2010)，還影響其共生細菌的增殖(Dunphy and Webster，1986)。線蟲溫度的適合范圍和它的采集地點有關，同一種線蟲在高寒地區分離到的品系嗜低溫，而在熱帶地區采集到的品系則適于較高溫度下生長發育和侵染寄主(余向陽等，2003)。本文測定結果表明格氏線蟲Sgib 品系侵染黃地老虎幼蟲適宜溫度在21℃-27℃，以24℃的致死率最高，溫度降至18℃會使線蟲的致死率明顯下降，15℃基本休眠，Sgib 可以忍受30℃的高溫，但感染力會下降，這與其他研究結果(Bakonyi and Nagy，2000)一致。

濕度影響線蟲的存活和移動(余向陽等，2003)。昆蟲病原線蟲在土壤中移動需要土壤間隙有水膜(劉樹森等，2010)，在濕度過低的情況下，線蟲的存活率明顯降低(余向陽等，2003)。孫瑞紅等(2004)在針對H.indica LN2 線蟲對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲侵染力的研究中也證實溫度和土壤含水量顯著影響線蟲的致病力。線蟲體表水膜張力對線蟲的行為影響要遠遠大于重力(Crofton，1954)。實驗表明，將線蟲液滴在培養皿上，線蟲活動能力隨水分蒸發而減弱，線蟲體表水分消失時，線蟲立即死亡。本試驗顯示隨著濕度的增加，格氏線蟲Sgib 侵染活性呈上升趨勢，不同濕度間差異顯著，在濕度最大時達到100%。

田間實驗按每667 m2施用1×109頭格氏線蟲Sgib，黃地老虎幼蟲死亡率達到96.6%，而對照組死亡率為1.33%，表明昆蟲病原線蟲對黃地老虎幼蟲有很好的致死效果。但隨后測定的線蟲田間持效期表明線蟲在田間96 h 后對大蠟螟致死率下降一半，288 h 后幾乎為檢測不到Sgib 線蟲的侵染。昆蟲病原線蟲在田間的生存受到溫度、濕度、土壤等非生物因子和天敵等生物因子的制約(Chitwood，1937)，有研究表明將S.feltiae 線蟲懸浮液施放在土壤后，2 周后就很難從土壤中回收。本實驗持續期間，平均溫度在13℃-27℃，天氣晴，96 h 時田間5 cm 土壤的總含水量約13.21%，192 h 總含水量降低到5.89%，因此，土壤濕度可能是影響線蟲在土壤中持效期的主要因素。黃地老虎幼蟲3 齡之前全天都在寄主植物葉片上取食活動，在3 齡以后才入土隱蔽，并且晚上在表土層活動取食，因此，田間噴施線蟲應在在黃地老虎3 齡以后，并且應選擇在傍晚噴施才能取得好的防治效果。

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