醫學實驗室中離心機的應用與技術保障*

周 末　姚　璐　高　建　崔澤實*

醫學實驗室中離心機的應用與技術保障*

周 末①姚璐①高建①崔澤實①*

周末,男,(1984- ),本科學歷，實驗師。中國醫科大學實驗中心三部，從事生物樣本制備、顯微成像分析等實驗技術研究工作。

目的：規范醫學實驗室離心技術的應用與儀器維護。方法：正確選擇與應用離心技術，掌握相對離心力(RCF)、S值及K值等常用離心參數的運用與計算方法，合理配置離心轉頭與離心容器，根據材質的理化耐受性選用和處理離心容器，制定基于風險控制的操作規范、監測、維護、保養以及生物安全等系列措施，建立實驗室離心機技術保障。結果：通過規范醫學實驗室離心技術的應用，使實驗室離心機的故障率降低，工作效率得到提升。結論：保障離心機正常使用，必須堅持從實驗應用到工程維護的全技術流程管理。

離心機；離心技術；技術保障；維護；醫學實驗室

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.05.006

[First-author’s address] China Medical University, Shenyang 110001, China.

醫學實驗室離心機用于醫學實驗樣品制備，離心是利用離心機驅動離心容器做旋轉運動產生的離心力以及被離心樣本物質的沉降系數或浮力密度的差別，完成分離、濃縮及提取制備，分析測定生物分子分子量及純度的一項常規實驗技術，其應用覆蓋醫學乃至生命科學諸多專業實驗[1]。因此，研究離心力與被離心樣品間的相互作用關系，規范使用和維護技術流程甚為重要。本研究探討規范醫學實驗室離心技術的應用與儀器維護，旨在制定風險控制的操作規范、監測、維護、保養以及生物安全等系列措施，建立實驗室離心機技術保障。

1　醫學實驗室離心技術的選擇

根據離心機相對離心力(relative centrifugal force，RCF)上限和主要應用，醫學實驗室常用離心機大致可分為低速離心機、通用離心機、高速離心機及超速離心機4種。

1.1離心機的選擇

(1)低速離心機。RCF≤7 000 g；細胞或細胞碎片沉降分離，過濾、透析、親和柱提純；大容量機型(4～12 L)常用于血站或血庫實驗室。

(2)通用離心機。RCF≤30 000 g；除具備低速功能外還部分兼顧核酸、蛋白及質粒提取等高速功能[2]。

(3)高速離心機。RCF≤100 000 g；核酸、蛋白及質粒提??；兼顧亞細胞結構和病毒分離；密度梯度離心。

(4)超速離心機。RCF≤1 050 000 g；核酸純化CsCl；亞細胞結構、細胞器、病毒及脂蛋白分離；密度梯度離心[3]。

1.2常用離心參數

(1)離心速度。在離心驅動系統帶動下轉頭旋轉的速度，單位為每分鐘轉數(revolution per minute，RPM)(r/min)。

(2)相對離心力。物體以一定的角速度做圓周運動就產生離心力F=ω2r。但離心力要克服與其相垂直的地球重力(gravity)以及樣品粒子的摩擦力和浮力影響(后兩者可忽略不計)，故以RCF表示，RCF=ω2r/980，等于在離心場中作用于樣本粒子上的離心力相當于地球重力的倍數，單位是重力加速度g(1 g＝980 cm/s2)，RCF1000×g則是重力加速度的1000倍。RCF的大小與離心速度及在離心容器中粒子距心軸的路徑(實際離心半徑)有關，即RCF=1.12 r(RPM/1000)2，故有最大、平均和最小RCF之分。樣品粒子能否得到有效分離主要取決于RCF，文獻中常給出最大RCF為離心條件。轉頭額定轉速所對應的RCF可以通過離心半徑-RCF-RPM曲線換算，但精確RCF值應查找生產廠轉頭參數表。

(3)沉降系數(sedimentation coefficient，S)。是樣本粒子重要的物理化學參數，以Svedbergs值(S值=10-13s)表示對應離心力樣品粒子的沉降速率，不同S值樣品粒子所需離心時間(完全沉降至容器底部)的表達式為t=1/S ω2· ln rmax/rmin[4]。常見分離生物樣本的S值及參考離心條件見表1。

表1　常見離心樣本的參考S值及離心條件

(4)K因數值(K-factor)。反映離心轉頭的效率，與其大小、材質和速度有關。利用K值可估算出某S值樣本粒子的沉降時間：t=K/S；K值越小，轉頭離心效率越高，粒子沉降所需時間越短[5]。

2　醫學實驗室離心機的離心技術

根據離心力與被離心物質間的相互作用方式，可分為差速離心與密度梯度離心。

2.1差速離心

差速離心是利用離心樣本組分中不同沉降系數粒子的沉降速度差別(如各細胞組分)，經一定速度、一定離心力及一定時間離心，先后沉降而得到分離。在此過程中樣本往往被分離為沉淀物和上清液兩部分，其前提是待分離的兩種或數種粒子的S值的差值足夠大(至少差10倍以上)方能得到較好的分離，如果兩種或數種粒子的S值相差極小，則難以得到好的分離。關鍵要精確控制好分步離心的時間和速度，時間過長或轉速過高會使不該沉降的顆粒而沉降下來，影響分離純化效果[3]。

2.2密度梯度離心

密度梯度離心是樣本在有密度梯度的惰性介質液中進行離心沉降或沉降平衡，即在一定離心力作用下將粒子分配到梯度液中相應的位置上，形成不同區帶而得到分離[6]。密度梯度離心又可分為密度梯度沉降離心或差速區帶離心和等密度離心

(1)密度梯度沉降離心或差速區帶離心。用于分離粒子大小、形狀各異(存在一定的沉降系數差)而密度相近的樣本，梯度液密度＜樣本組分密度。先將樣本液加在梯度液液面上，在離心力作用下粒子各自以一定的速度沉降，逐漸分離在離心容器中依沉降系數大小形成由下至上的區帶。需精確設定離心時間(各樣本區帶間拉開到最大距離后即停機)，降速不可過快。

(2)等密度離心。待分離樣本粒子的密度在密度梯度液密度范圍內，離心前加樣其中呈均勻分布，在離心力的作用下，依不同粒子的浮力密度差，或向下沉降、或向上浮起，最終沿梯度移動到與其恰好相等的密度梯度位置上(即等密度點)形成區帶。離心效果取決于粒子的浮力密度差，差值越大分離效果越好，與粒子的大小、形狀無關，但后兩者涉及到平衡的速度、時間及區帶的寬度。離心時間通常長于差速區帶離心。

表2　離心轉頭在不同離心技術的適用性

2.3離心轉頭的選擇

實驗室離心機最常配置是固定角轉頭和水平轉頭，個別生產廠還可提供鼓式轉頭、細胞離心涂片裝置等；高速及以上離心機還可配置垂直、近垂直及區帶轉頭等。選擇轉頭主要依據離心技術需求，3種主要離心技術的轉頭選擇見表2[7]。

2.3.1離心條件的轉換計算

當離心技術確定后完成某種樣品的有效離心分離，常關注的離心參數是S值、RCF及離心時間。多數情況下這些參數主要從文獻中獲得，存在的問題是，文獻上給出的離心條件往往與所在實驗室可利用離心機的性能有一定差異，如何將文獻離心條件轉化在本實驗室離心機上使用，其常用計算方法如下。

(1)在給出T1值和RCF1值的情況下，根據實驗室現有離心轉頭RCF2轉換所需T2∶T2=T1×RCF1/ RCF2。

(2)在給出T1值和K1值的情況下，根據實驗室現有離心轉頭K2轉換所需T2∶T2＝T1×K1/K2。

獲得精確計算，重要在于建檔管理離心機的使用說明書及使用記錄等技術資料，隨時可調用參考[8]。另轉換范圍控制在20%為宜，不可偏離過大，無足夠的離心力即便延長離心時間同樣毫無意義。

2.3.2離心容器的選擇

除要考慮離心容器的式樣、容量外，常被忽略的是容器的物理及化學耐受性，材質不同的塑料離心管物理和化學耐受性各異，常發生由于錯選材質而導致容器溶裂、破損，有機溶劑濺出腐蝕儀器事件。常用離心容器材質為多聚物(Polyallomer，PA)、聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)、聚丙烯(Polypropylene，PP)、聚砜(Polysulfone，PSF)、聚乙烯(Polyethylene，PE)和聚苯乙烯-Polystyrene(PS)，其理化耐受性見表3。

3　醫學實驗室離心機操作注意事項

離心機的使用存在著一定的風險，應將風險評估理念貫穿于離心的全過程，并規范操作。

3.1必要的檢查與測試

(1)檢查離心容器與離心轉頭孔位或套筒適配性，在高速離心時應保證離心容器與離心轉頭孔位適形，尤其是在使用錐形底管的情況下，避免在強離心力作用下管底堆陷。檢查離心轉頭尤其是高速以上轉頭，檢查其外觀有否劃痕或裂紋，根據情況決定是否停用或減速使用(至少減速額定轉數的10%。定期核查對超速離心機驅動系統及其轉頭的累計使用時間，一旦超過生產廠給定的保證期要做出減速評估。

(2)檢查真空泵的油水平和實際真空度，如真空路徑裝有HEPA濾器，要復核其使用時間。

(3)檢查離心艙內及轉頭或離心容器適配器件內有否離心容器碎片和殘留水等異物，并清除之，復核轉頭和水平轉頭的離心吊桶是否安放到位。

(4)檢查離心容器有否變形、裂紋、損傷或老化現象，擦干離心容器外壁上的水跡。

(5)檢查離心容器加樣量，一般原則是無蓋容器不可裝滿，以免離心甩出。而在高速或超速離心時使用帶有密封器件或壓封蓋的容器時，則常要求裝滿以避免在離心力作用下造成變形陷裂。可參考生產廠提供的轉頭及容器手冊，會標明不同形狀、材質離心容器在不同轉速時額定加樣量。

(6)超速離心機的使用者要經過培訓、考核取得資質后方可上崗操作，并由專人負責管理。

3.2離心配平

離心配平是指離心轉頭及離心吊桶的管位幾何學對稱重量平衡，乃至轉頭整體平衡，保證轉頭負載分布均勻。①不可采取容量配平，尤其是在高速以上離心，因為離心容器、加樣器等會存在偏差；②檢查離心轉頭及離心吊桶管位內有否殘留有容器碎片或水溶液，由于制冷離心后放置一定時間也可出冷凝水，因此需排除潛在的不平衡因素；③檢查水平頭安裝的吊桶自重是否對應配平，生產廠會在吊桶上標記重量，當裝載不同容量樣本一起離心時，盡量避免使用兩對自重差別較大的管架。

表3　不同材質離心容器的理化耐受性

近代離心機多裝有失平衡保護功能，要嚴格控制偏差在額定重量以內；但最佳選擇是堅持在天平上精密完成一對一配平操作，避免離心驅動系統常在不平衡調整狀態運行。在吊桶或管架中放多管離心時應連同吊桶一起完成配平。

3.3預冷

預冷系指轉頭及其裝載附件和離心艙的預冷。先將轉頭放入冰箱或冷室，以保證轉頭整體預冷。離心艙和小體積轉頭的預冷，可在離心前設置控制溫度，在1 000～2 000 RPM運轉10～20 min，視室溫；或使用離心機預置的預冷(pre-cooling)程序。

3.4其他

啟動離心機后不能隨即離開實驗室，應監測機器運行到設定轉速平穩、且無任何異常聲響后方可離開。但使用高速、超速離心機時不可離開，需密切監測儀器運行狀況。如開啟離心艙蓋后轉頭還在余轉，禁忌用手制停。疑有生物污染的樣品時應在生物安全柜中上樣，離心后在生物安全柜中靜置數分鐘待氣溶膠下落后方可打開轉頭密封蓋取樣，BSL3級及以上實驗室內的離心操作須參照其相關規范[9]。

4　醫學實驗室離心機常規維護

必要的維護與保養措施是保障離心機正常使用的首要前提，應參考儀器操作說明書制定規范，納入實驗室常規技術流程。

4.1定位與調平確認

安裝是離心機維護與保養的基礎步驟，儀器操作負責人應參加安裝全過程。移動離心機位置安裝后應注意以下事項。

(1)離心機的安裝位要避開陽光直曬、灰塵、通風不良、熱輻射、過度振動、存在腐蝕性化學物質以及洗刷池等。附近不可放置天平、光度計及顯微鏡等精密儀器[10]。

(2)移動冷凍離心機到位后靜置60 min或更長時間(視搬運的劇烈程度)后方可開機。

(3)確認儀器工作電壓、電流、頻率及相位等技術參數，連接電源應滿足儀器啟動最大功率要求的115%或更多，且必須有接地，功耗較大的落地式高速機及超速機應另外單獨配置氣動開關[11]。

(4)臺式離心機安放的實驗臺要平整、結實及無晃動，離心機的支腳應與實驗臺的支撐柱對應；為了便于儀器散熱、維護及檢修，安放時距墻壁或周邊設施≥20 cm，有條件的可再寬余些。

(5)落地式機型需評估地面或樓板的承重能力，選擇在墻側為宜；其他同臺式機。

(6)使用經校準的水平測具置于離心中軸位測量360o方位的水平狀況，進行離心機定位水平調整。

4.2維護保養措施

(1)離心艙。用軟布擦拭清理離心艙，除去殘留物，但注意不可傷及溫度傳感器；制冷離心化水后應及時擦干，保持開艙蓋晾干后關閉；離心艙密封膠圈不可用有機溶劑擦拭，真空不足時應檢查膠圈是否有臟物或老化；發現艙壁有銹蝕時應及時采取除銹處理。

(2)使用較頻繁的低速及通用離心機離心時應定期卸下轉頭清理軸桿；用毛刷清理離心軸桿的螺旋縫隙，涂抹潤滑膏，以免垢污填塞，反復旋擰損傷螺口。停用間期應卸下轉頭進行保養。

(3)離心轉頭。用軟木棒纏綁軟布或脫脂棉擦拭清理轉頭或管架孔位，制冷離心后及時清除水跡。用毛刷清理轉頭與驅動軸擰固處的螺旋縫隙，用軟布擦去水平轉頭與吊桶懸掛位的污垢，并涂抹潤滑膏。

(4)檢查轉頭、離心吊桶的密封膠圈有否老化、變形及斷裂等現象，并及時更換。

(5)保持離心實驗室內清潔，定期除去機箱散熱網灰塵，特別是壓縮機處。

(6)離心機閑置1個月以上時，期間要開機轉載轉頭運行1次，觀測是否有異常聲響，能否達轉速、制冷溫度等額定指標。長期不用的轉頭要做清潔處理，涂保護劑。

(7)檢查離心機電源插頭及連接插座有否接觸不良和燒焦現象，電源線有否老化，發現問題及時處理。定期檢查真空管路及相關設施連接狀況，濾器是否阻塞。

(8)機箱表面的污跡只能用軟布沾清水或近中性且無磨損的清潔劑清理，禁用干布、有機溶劑擦拭顯示面板及艙蓋上方的觀察窗。

5　結語

正確使用和必要的監測、維護措施是發揮離心機技術效率的重要保障，不可忽視每個技術環節。實驗室在實施離心機應用技術保障體系的同時，應加強對實驗者的技術培訓，面向研究生開設選修課程，降低離心機故障率，為學?？茖W實驗研究、實驗教學及所在地區的共享服務提供有效的技術支撐。

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Application and technical support of centrifuges in medical maboratories

ZHOU Mo, YAO Lu, GAO Jian, et al

China Medical Equipment,2015,12(5)∶20-24.

Objective∶ To establish the good practice of the application and maintenance of the centrifuges in the medical laboratories. Methods∶ By correct selection of centrifuge technology, to know well the technical parameters of the centrifuges and calculation methods, reasonable configuration for rotors and containers, processing according to the physical and chemical resistances of the centrifugal containers, set up technical support system by formulating maintenance measures of the centrifuges based on risk control. Results∶ Centrifuge failure in the laboratory is reduced, the technical efficiency increased. Conclusion∶ In order to keep a good operating practice of the centrifuge, need to perform total technical procedures management from the experiment application to the engineering maintenance.

Centrifuge; Centrifugal technology; Technical support; Maintenance; Medical laboratory

1672-8270(2015)05-0020-05

R197.39

A

遼寧省科學事業研究公益基金(2012006005)“提升高校中心化實驗室共享服務效益的優化運行模式及機制研究”；沈陽市生命科學實驗技術重點實驗室建設(F12-264-4-01)“分子細胞計量學實驗技術數字資源共享服務平臺”

①中國醫科大學實驗中心三部 遼寧 沈陽 110001

labczs@mail.cmu.edu.cn

2015-01-08