西施舌3個(gè)群體H2A基因和nad6-nad1片段序列比較研究

朱 明, 申 欣, 朱笑琳, 屠海淼, 楊 婕, 孟學(xué)平

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港222005)

基于形態(tài)學(xué)[1-2]和同功酶[1]資料、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和 16S rRNA 基因[3]、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)[4]、細(xì)胞色素c氧化酶亞基 1基因(cox1)[5]、細(xì)胞色素b基因(cob)[6]等核DNA和線粒體DNA資料分析顯示, 中國(guó)黃、渤海西施舌(即墨、膠南、日照、連云港和啟東)以及南方的廣西北海群體與福建群體(長(zhǎng)樂(lè)、漳州)發(fā)生了高水平的遺傳分化[1]。作者用比較線粒體基因組學(xué)的資料[7]從全基因組結(jié)構(gòu)差異角度揭示漳州西施舌發(fā)生了明顯的分化, RAPD分析也認(rèn)為福建(長(zhǎng)樂(lè))群體發(fā)生了明顯的分化[8], 福建群體可能是西施舌的一個(gè)亞種或是腔蛤蜊屬的新種。上述資料為西施舌群體遺傳分化提共了有力的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)證據(jù), 但是根據(jù)現(xiàn)有資料確定福建西施舌是西施舌的亞種或是隱種, 證據(jù)尚顯不足, 還需更多的資料證實(shí)。

組蛋白是真核生物染色質(zhì)的基本單位—核小體的重要結(jié)構(gòu)成份, 也是基因表達(dá)調(diào)控的重要成份[9-10], 特別是與核小體的組蛋白變體與基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和染色體的異染色化有關(guān)[11]。組蛋白H2A家族的成員之一H2AX與DNA損傷修復(fù)、基因組穩(wěn)定性維持及腫瘤抑制有關(guān)[12-13], 組蛋白還有抗菌作用[14]。后生動(dòng)物組蛋白基因?yàn)槎嗫截? 如海膽基因組有 2套編碼無(wú)多腺苷酸尾 mRNA的組蛋白基因, 其中編碼核心組蛋白的基因有34個(gè), 分散存在于基因組的不同位置, 還有編碼組蛋白變體的基因[15]。組蛋白基因很保守, 如親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的后生動(dòng)物海膽組織的H3與小牛胸腺H3序列只差1個(gè)氨基酸, 小牛胸腺H3與豌豆H3只有4個(gè)氨基酸不同。組蛋白中H2A的保守性為中度, 若福建西施舌與其他群體 H2A仍然存在明顯的差異, 則能補(bǔ)充說(shuō)明上述分子生物學(xué)資料證據(jù), 因此, 基于組蛋白核苷酸的西施舌群體遺傳差異分析資料顯得尤為重要。NADH脫氫酶亞基 6基因(nad6)和亞基1(nad1)基因間有2個(gè)tRNA基因和1個(gè)非編碼區(qū)[7], 因此, 在nad6的5′端和nad1的3′端設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的片段(nad6～nad1)包括nad63′、nad15′端部分序列,tRNAGln和tRNAThr2個(gè) tRNAs基因序列及其之間的非編碼區(qū)(約 100bp),nad6～nad1區(qū)域能夠同時(shí)反映蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA基因和非編碼區(qū)核苷酸差異, 可提供有效的群體差異分析資料。核基因組DNA和線粒體 DNA資料相互印證, 分析結(jié)果更有說(shuō)服力。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用西施舌(Coelomactra antiquata)采自山東日照、福建漳州、廣西北海沿海。取西施舌斧足肌肉酒精固定4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

取乙醇保存西施舌組織浸出乙醇或新鮮組織研碎, 用SDS-蛋白酶K裂解組織, 酚-氯仿抽提蛋白質(zhì),乙醇沉淀DNA。詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)[4]操作, 個(gè)別步驟稍作修改。

1.3 H2A區(qū)和nad6～nad1片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

用 SeqMan軟件對(duì)作者已經(jīng)測(cè)定的西施舌浮游幼蟲(chóng)表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)進(jìn)行拼接, 獲得含有組蛋白H2A編碼區(qū)的DNA序列, 用Primer-BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools /primer-blast/)在線從編碼區(qū)兩翼的非編碼區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物, 引物名稱及序列如下： HP83-F： GAA AGT CCC TGC CGA ACA；HP83-R： GAA GCA CAC TCG CAC ACC T； PCR 退火溫度為52 ℃ , 25μL 體系, 延伸時(shí)間40 s, 35個(gè)循環(huán)。根據(jù)西施舌[16-17]、四角蛤蜊[7]和中國(guó)蛤蜊(作者測(cè)序未登錄)nad63′端和nad15′端分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增nad6～nad1片段上下游引物 YJ-4clam-na6-F： GCY GCT GCK CGY ATD TGT AG 和 YJ-4clam-nd1-R：TGY GCA ATA GCA CGY ATA GC。擴(kuò)增條件： 退火溫度54℃, 延伸時(shí)間45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)有限公司雙向測(cè)序。

1.4 DNA序列生物信息學(xué)分析

雙向測(cè)序結(jié)果用 DNAStar軟件包中的 SeqMan拼接, 結(jié)合測(cè)序峰圖對(duì)序列進(jìn)行人工校對(duì)。用ClustalX (1.83)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)并取齊, 用SPSS 17.0進(jìn)行堿基含量差異顯著性分析； 用DnaSP v5.1軟件進(jìn)行基因型或單倍型確定； 用MEGA4.0進(jìn)行核苷酸序列差異分析： 統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn), 根據(jù)Kimura 2-parameter(K-2P)計(jì)算遺傳距離； 用 Arlequin v3.1進(jìn)行分子方差分析(AMOVA), 群體間遺傳分化指數(shù)(FST)計(jì)算采用pairwise difference模型。

2 結(jié)果

2.1 H2A基因區(qū)核苷酸序列基本信息

本研究共獲得西施舌日照(RZ, 10個(gè)樣本)、北海(BH, 7個(gè)樣本)和漳州(ZZ, 6個(gè)樣本)3個(gè)群體H2A基因區(qū)(包括 H2A編碼基因和基因兩翼的非編碼區(qū))序列 23條, 去除兩端不可信序列后所得序列長(zhǎng)度為606bp(RZ, BH)或 616bp(ZZ), 同源序列存在長(zhǎng)度多態(tài)性； 經(jīng)DnaSPv5對(duì)23條序列分析共獲得9種基因型(Gen), 其中, Gen1～3、Gen 5由日照和北海群體共享, Gen 4為日照群體獨(dú)享, 北海群體無(wú)獨(dú)享單倍型,說(shuō)明日照、北海西施舌存在基因交流。Gen6-9為漳州群體獨(dú)享, 西施舌漳州群體與其他 2個(gè)群體無(wú)交叉共享基因型, 無(wú)基因交流； Gen 1～5 (RZ, BH)堿基平均含量(%)分別為 T ： 23.0、C ： 26.2、A ： 27.5、G ：23.3, Gen 6～9(ZZ)堿基平均含量(%)分別為 T ： 23.3、C ： 26.0、A ： 28.2、G ： 22.5, 前者的 AT 含量(%)為50.6, 后者的為51.5, 堿基含量存在差異。

2.2 H2A基因序列比對(duì)分析

將H2A基因區(qū)片段23個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析, 共獲得 616個(gè)比對(duì)位點(diǎn)(圖 1), 其中變異位點(diǎn)(V)30個(gè),占比對(duì)位點(diǎn)的 4.86%, 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Pi)25個(gè), 占4.05%。日照、北海群體合并為一組計(jì)算, 組內(nèi) V位點(diǎn)4個(gè), Pi位點(diǎn)1個(gè), 漳州群體內(nèi)V位點(diǎn)5個(gè), 無(wú)Pi位點(diǎn)； 在 616個(gè)比對(duì)位點(diǎn)中, H2A開(kāi)放閱讀框(ORF)(375bp)相對(duì)保守, 只有 6個(gè)變異位點(diǎn), 占變異位點(diǎn)的 20%(此區(qū)在圖 1中只列出一部分), 其中有 3個(gè)位點(diǎn)為漳州群體共享單核苷酸突變位點(diǎn), 變異發(fā)生在密碼子的第 3位, 未引起氨基酸組成的改變； 兩翼分別是基因上游和下游非編碼區(qū), 其中1～106位點(diǎn)為上游非編碼區(qū), 漳州群體在此區(qū)10～19位點(diǎn)有一段10堿基(CCCGCTGATC)的插入序列(圖1左側(cè)虛框所示),在56～96位點(diǎn)區(qū)有一堿基高變區(qū)(圖1右側(cè)虛框所示)；482～616位點(diǎn)為下游非編碼區(qū), 此區(qū)漳州群體有7個(gè)共享單苷酸變異位點(diǎn)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), H2A基因ORF的上游變異較大, 有插入序列和高變區(qū), 而 ORF的下游變異相對(duì)小, 但ZZ群體ORF上、下游序列中均有標(biāo)志性的變異位點(diǎn), 可作為ZZ群體的分子標(biāo)記。

圖1 西施舌H2A基因區(qū)兩翼部分序列比對(duì)Fig.1 Flanking sequences comparison of H2A gene of Coelomactra antiquata

H2A基因區(qū)基因型序列比對(duì)顯示, 在30個(gè)變異位點(diǎn)中, 西施舌漳州群體有 23個(gè)共享變異位點(diǎn), 其中在基因區(qū)有 3個(gè)共享變異位點(diǎn), 兩翼序列中有 20個(gè)。日照、北海西施舌有26個(gè)共享變異位點(diǎn)(圖2), 漳州西施舌與日照、北海西施舌無(wú)共享變異位點(diǎn), 說(shuō)明無(wú)基因交流。

圖2 西施舌H2A基因型序列比對(duì)Fig.2 H2A genotype sequence comparison of Coelomactra antiquata

2.3 基于H2A基因區(qū)的遺傳距離

根據(jù)基因型核苷酸序列, 用Clustalx軟件比對(duì)后,用MEGA軟件計(jì)算遺傳距離(K-2P) (表1), 將漳州群體分為一組, 日照、北海群體分為另一組(混合組)。結(jié)果顯示, 混合組組內(nèi)遺傳距離 0.002～0.005, 平均為0.003, 漳州組組內(nèi)遺傳距離為0.002～0.007, 平均為 0.004, 混合組與漳州組間的遺傳距離為0.041～0.048, 平均為0.044。組間遺傳距離與組內(nèi)(漳州組)遺傳距離之比為 11。分子方差分析(AMOVA)顯示兩組間的FST= 0.9370(P＜0.01), 說(shuō)明兩群體間發(fā)生了極顯著的遺傳分化。

2.4 西施舌漳州、日照群體 nad6～nad1片段差異分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序獲得 710bp左右的nad6～nad1片段, 將全部序列經(jīng)Clustalx取齊后得到547個(gè)比對(duì)位點(diǎn), 從 2個(gè)群體中共獲得 20條nad6～nad1序列(每個(gè)群體10個(gè)樣本), 核苷酸含量統(tǒng)計(jì)顯示RZ群體T、C、A、G含量分別為40.5%、10.5%、27.5%、21.5%, A+T平均含量為68%, 明顯高于C+G含量。ZZ群體T、C、A、G含量分別為38.5%、11.0%、28.1%、22.4%, A+T平均含量為66.6%。2個(gè)群體中的T、G含量存在顯著差異(P＜0.01), RZ群體T顯著高于ZZ群體, 而G顯著低于ZZ群體。

表1 基于西施舌H2A基因區(qū)核苷到序列的遺傳距離Tab.1 Genetic distances based on H2A gene region nucleotide sequence of Coelomactra antiquata

對(duì)nad6～nad1片段的核苷酸序列檢測(cè)獲得 7種單倍型(hap), 其中漳州西施舌10個(gè)個(gè)體有2種單倍型(hap1, hap2), RZ群體 10個(gè)個(gè)體有 5種單倍型(hap3～hap7), 漳州群體與日照群體無(wú)交叉共享單倍型； 對(duì)7種單倍型進(jìn)行序列比對(duì)顯示, 變異位點(diǎn)占比對(duì)位點(diǎn)的16.5%(圖3), 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占15.7%。2群體間的遺傳距離(K-2P)0.199～0.202, 平均為 0.200,群體內(nèi)平均遺傳距離分別為 0.003(RZ)和 0.004(ZZ),群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比為50～66。

nad6和nad1之間有tRNAGln和tRNAThr2個(gè)tRNA基因和tRNAs基因間非編碼區(qū)。用于比對(duì)的序列5′端nad6部分因質(zhì)量差全部被切除,tRNAGln5′端部分被切除,3′端只剩下9個(gè)堿基, 其后依次是96bp的非編碼區(qū)(NCR96),tRNAThr、4bp的非編碼區(qū)和最后的368bp的nad1區(qū)域(圖3)。圖3顯示在NCR96(96個(gè)位點(diǎn))區(qū), 漳州、日照群體有 4處堿基缺失/插入,且在tRNAThr、nad1編碼區(qū)均有堿基缺失和插入序列, 兩個(gè)群體nad6～nad1片段的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在極大的差異, 包括單核苷酸的高頻率突變與堿基的缺失和插入(圖3)。將此nad1片段翻譯成氨基酸序列, 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在 N-端前 20個(gè)氨基酸變異很大(圖 4),此區(qū)日照西施舌 nad1缺失“QILWVQ”6個(gè)氨基酸,且在第3、6、13、14、16、17、20、25、113位等 9個(gè)座位的氨基酸不同。

3 討論

本研究結(jié)果顯, H2A 基因型Gen1～3, Gen5為北海群體和日照群體所共享, 而北海群體與漳州群體發(fā)生了明顯的遺傳分化, 這種現(xiàn)象不符合地理距離產(chǎn)生遺傳分化的理論。說(shuō)明在進(jìn)化歷史過(guò)程中, 西施舌日照、北海群體有基因交流發(fā)生。日照與北海的地理距離很遠(yuǎn), 通過(guò)海洋進(jìn)行的基因交流幾率很小,基因交流由人為生成的可能性相對(duì)大, 其確切原因有待進(jìn)一步研究。然而基因型Gen6～9為漳州西施舌特有, 與日照、北海西施舌無(wú)共享現(xiàn)象, 只有 Gen8為漳州西施舌 3個(gè)不同個(gè)體共享。這說(shuō)明漳州西施舌與日照、北海西施舌無(wú)基因交流。nad6～nad1序列分析也顯示漳州群體和日照群體無(wú)交叉共享單倍型,從線粒體基因角度證實(shí)在演化歷史上這 2個(gè)群體間無(wú)基因交流, 已經(jīng)發(fā)生了遺傳分化。

關(guān)于福建(長(zhǎng)樂(lè)、漳州)西施舌遺傳分化的研究已有報(bào)道,cox1分析顯示福建(長(zhǎng)樂(lè)、漳州, 稱為 DH組)西施舌與黃、渤海、北部灣(稱為BH組)西施舌間的遺傳距離為0.0 837, 而DH組和BH組組內(nèi)遺傳距離分別為 0.0047和 0.0035, 組間與組內(nèi)遺傳距離之比為17.8和23.5[5]。 基于cox1缽水母綱13個(gè)屬屬內(nèi)種間遺傳距離(K-2P)在 0.056～0.381, 種內(nèi)平均遺傳距離為 0.013, 種間與種內(nèi)遺傳距離之比為4.3～29.3[18], 西施舌DH與BH組間與組內(nèi)遺傳距離之比值在此范圍內(nèi)；cob分析顯示長(zhǎng)樂(lè)西施舌與非長(zhǎng)樂(lè)西施舌(大連、啟東、北海群體)間的遺傳距離為0.191～0.209, 而長(zhǎng)樂(lè)群體和非長(zhǎng)樂(lè)群體內(nèi)平均遺傳距離為 0.010, 群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比為19.1～20.9倍[6]； 16S rRNA分析顯示長(zhǎng)樂(lè)群體與非長(zhǎng)樂(lè)群體(遼寧大連、山東即墨、膠南、日照、連云港、啟東、廣西)間的遺傳距離平均為0.081, 群體內(nèi)的遺傳距離為 0.007, 兩者之比為 11.6[19], 上述研究顯示長(zhǎng)樂(lè)群體與非長(zhǎng)樂(lè)群體間遺傳距離之比值均大于11.6； ITS1分析顯示長(zhǎng)樂(lè)群體與非長(zhǎng)樂(lè)群體間的平均遺傳距離為 0.0329, 群體內(nèi)遺傳距離平均為 0.0088,群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比為3.7[4]； ITS2分析顯示長(zhǎng)樂(lè)群體非長(zhǎng)樂(lè)群體間遺傳距離平均為 0.029, 群體內(nèi)平均遺傳距離為 0.012, 兩者之比為 2.42[19]； 本研究發(fā)現(xiàn)漳州西施舌與非漳州(日照、北海)西施舌間的遺傳距離平均為 0.044, 而群體內(nèi)的遺傳距離平均為 0.004, 兩者之比達(dá) 11。不同基因解析能力不同,但有規(guī)律可循, ITS1和ITS2群體間與群體內(nèi)遺傳距離之比值在2.4～4.2, 不大于5, 而線粒體基因組此值大于 10, 這達(dá)到了“10×”規(guī)則的標(biāo)準(zhǔn)[20-21], 說(shuō)明福建(長(zhǎng)樂(lè)、漳州)與其他群體西施舌發(fā)生了明顯的分化。特別是來(lái)自組蛋白基因兩翼序列的證據(jù)證明, 漳州西施舌發(fā)生了明顯的分化。組蛋白H2A基因在核心組蛋白中屬中度保守, 但在漳州和非漳州西施舌群體中相對(duì)保守, 只有 3個(gè)漳州群體特征性單核苷酸突變位點(diǎn), 但通過(guò)這 3個(gè)位點(diǎn)的堿基可識(shí)別漳州西施舌。H2A基因的兩側(cè)非編碼區(qū)突變率高, 在群體分子遺傳學(xué)研究中具有重要意義, 特別是組蛋白H2A編碼區(qū)上游-77至-86位的插入序列和-11至-50區(qū)的高變區(qū)可以作為漳州西施舌明顯的分子標(biāo)記(圖1方框), 在群體鑒別中具有重要意義。

圖3 日照、漳州西施舌nad6～nad1片段核苷酸序列差異分析Fig.3 Analysis of difference in nad6～nad1 fragment nucleotide sequence of Coelomactra antiquata from Rizhao and Zhangzhou coast

圖4 日照、漳州西施舌nad1 N′端氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence aligment of nad1 N′-end between Rizhao and Zhangzhou Coelomactra antiuqata

本研究擴(kuò)增了nad6和nad1基因之間的核苷酸序列, 用來(lái)比對(duì)的 DNA序列包括trnQ(9bp)部分序列、2個(gè)非編碼區(qū)(96bp+4bp)、trnT(63bp)全序列和nad1(371bp)部分序列(圖 3), 此 DNA片段的總堿基數(shù)雖不多, 但所包涵的信息卻很豐富, 這些信息顯示西施舌日照、漳州群體這個(gè)區(qū)域核苷酸差異極為明顯, 2個(gè)群體的7種單倍型有90個(gè)變異位點(diǎn), 2個(gè)群體nad1編碼的氨基酸有6個(gè)位點(diǎn)不同, 可見(jiàn)此區(qū)域是區(qū)分日照、漳州西施舌的更加有效的分子標(biāo)記。而漳州西施舌共享變異位點(diǎn) 84個(gè), 占變異位點(diǎn)的93.3%。本研究結(jié)果為西施舌的系統(tǒng)演化研究提供了來(lái)自核基因組和線粒體基因組的重要參考。

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