生防細菌K2-1對大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

方衛東 , 唐 旭 劉源森 林 凌 黃仕新 徐長安

(1. 國家海洋局 第三海洋研究所 福建 廈門 361005； 2. 集美大學 水產學院 福建 廈門 361005)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmu), 是產于歐洲的一種冷水性海產鲆鰈類[1], 山東是中國大菱鲆的主要養殖區, 居全國首位, 并帶動了遼寧、河北、天津、江蘇等地的大菱鲆養殖的發展[2-3]。然而隨著養殖規模不斷擴大、水資源缺乏、長期使用抗生素造成耐藥性的產生, 養殖病害發生率逐年提升, 給養殖業帶了巨大的損失[4]。研究表明：生物防治技術是解決養殖病害的有效措施之一。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)已被越來越多地研制成飼用微生態制劑, 其在促進動物營養的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病促生長等方面起到重要作用[5]。另外, 研究還表明蠟狀芽孢桿菌可以提高對蝦育苗的出苗率, 減少疾病的發生并提高產量[6]。本實驗室篩選到一株蠟狀芽孢桿菌 K2-1, 其發酵產物對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有很強的抑制作用,本研究探討了蠟狀芽孢桿菌K2-1的發酵產物對大菱鲆養殖常見致病——菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、愛德華氏菌(Edwardsiella)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制效果,并考察分析蠟狀芽孢桿菌 K2-1 抗菌物質的部分特性, 初步評估該菌株的使用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株

K2-1是本實驗室分離自福建省廈門市海滄港口污泥, 根據形態學觀察、生理生化特性和16S rDNA分析, 鑒定其為蠟狀芽孢桿菌。

1.2 測試菌和指示菌

測試菌為大菱鲆養殖常見致病菌, 包括副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌, 這些測試菌由青島農業大學從當地的大菱鲆養殖場病魚中分離獲得, 保藏工作正在進行中,實驗室攻毒試驗表明, 測試菌毒力較強； 指示菌為溶藻弧菌, 由福建師范大學教育部工業微生物重點實驗室提供。

1.3 培養基

LB培養基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g , pH 7.3, 水1 000 mL。

SLB培養基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g, 瓊脂20 g, pH 7.3, 水1 000 mL。

1.4 儀器設備

常規玻璃器皿、電子天平、超凈工作臺、打孔器、移液槍、臺式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標儀、恒溫培養箱等。

1.5 抑菌效果檢測

采用瓊脂擴散法進行測定[7]。通過測量圓形的透明帶(抑菌圈)直徑的大小來表示發酵上清抑菌活性的強弱。

1.5.1 抑菌板制作

選擇大菱鲆常見致病菌——副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌, 用接種環刮下菌體接種至裝有5 mL LB培養基的試管中, 放入溫度設置為 37 ℃, 轉速為 180 r/min的搖床中培養16 h后, 取1 mL的培養液至100 mL的45～50 ℃的SLB培養基中, 迅速搖勻, 倒板, 待凝固后, 每個抑菌板打6個孔。

1.5.2 發酵上清的制備方法

用接種環刮下K2-1菌體接種至裝有7.5 mL LB培養基的試管中, 放入溫度設置為 37 ℃, 轉速為180 r/min的搖床中活化6 h后, 倒入150 mL的LB培養基中, 放入溫度設置為37 ℃, 轉速為180 r/min的搖床中發酵15 h, 取發酵液, 經10 000 r/min, 6 min離心后, 再經0.22 μm兩次過濾, 去除菌體得發酵上清。

1.5.3 抑菌效果檢測

每個抑菌板的3個孔加入50 μL的發酵上清, 另外3個孔加50 μL未接種的LB培養基為空白對照,然后置于37 ℃生化培養箱中培養, 觀察、測量抑菌圈直徑, 并進行統計學分析。

1.6 抗菌物質的初步鑒定

將K2-1在上述LB培養基中發酵12h, 制得上清液, 上清液用飽和度為 60%的硫酸銨溶液沉淀,離心后得沉淀物和離心液, 對沉淀物進行透析除鹽,所得透析液與離心液分別用上述瓊脂擴散法檢測抑菌活性并比對抑菌能力, 初步檢測抗菌物質是否含有蛋白(肽)類成分。

1.7 抗菌物質部分特性分析

[8～13], 以福建師范大學教育部工業微生物重點實驗室提供的溶藻弧菌為指示菌, 考察不同的發酵時間、溫度、酸堿度(pH值)、紫外線、蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K、木瓜蛋白酶)對發酵上清抑菌活性的影響, 每個水平設定3個重復。

1.7.1 發酵時間對抑菌效果的影響

發酵時間設定 4、8、12、16、20、24、28 h , 每個時間點取發酵上清, 按照1.5的方法檢測發酵液的抑菌效果, 并同時用比濁法測定K2-1菌液的OD600,繪制生長曲線。

1.7.2 發酵上清對溫度的耐受分析

發酵上清分別在溫度設定為： 40、50 、60 、70 、80 、90 ℃的水浴鍋中水浴加熱10 min, 按照1.5的方法檢測其抑菌活性。

1.7.3 發酵上清對pH值的耐受分析

發酵上清分別在 pH值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 處理發酵上清3 h, 然后調回原值, 并稀釋至同體積, 避免濃度的影響, 且以未用酸堿處理的發酵上清作為對照(pH值為7.3)。并按照1.5的方法檢測其抑菌活性。

1.7.4 發酵上清耐受紫外線照射分析

發酵上清分別在紫外線下照射10、20、40、60 min,且以未進行紫外線照射的發酵上清為對照。并按照1.5的方法檢測其抑菌活性。

1.7.5 發酵上清對蛋白酶的敏感性分析

分別選取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4種酶質量濃度均為1 g/L)在37 ℃水浴條件下與發酵上清進行酶解反應4 h后, 在70 ℃下水浴30 min,滅活各蛋白酶, 并按照1.5的方法檢測其抑菌活性。

1.8 數據處理

采用SPSS11.5 軟件進行相關數據的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 蠟狀芽孢桿菌K2-1對大菱鲆常見致病菌的抑制效果

拮抗實驗結果表明： 如表1及圖1～圖5所示, 蠟狀芽孢桿菌K2-1對大菱鲆養殖常見致病菌, 包括副溶血弧菌, 愛德華氏菌, 哈維氏弧菌, 嗜水氣單胞菌,溶藻弧菌均有較強的抑制作用, 其中對嗜水氣單胞菌的抑制作用最強。

2.2 抗菌物質初步鑒定結果

發酵液經離心及過濾去菌體、鹽析、透析后, 離心液和透析液以溶藻弧菌為指示菌, 在同一個培養板中進行抑菌活性檢測, 抑菌結果如圖6所示, 可以明顯看出, 透析液的抑菌圈最大, 且明顯大于離心液的抑菌圈, 原因是透析液濃縮了抗菌蛋白。基于硫酸銨對蛋白質的特異性沉淀性質, 可以判斷, 抗菌物質含有蛋白(肽)類成分, 至于發酵上清中是否還含有其它非蛋白(肽)類的抗菌物質, 則還需進一步進行實驗分析。

表1 蠟狀芽孢桿菌 K2-1發酵上清對大菱鲆常見致病菌的抑制效果Tab. 1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against selected pathogens of Scophthalmus maximus

圖1 K2-1發酵液對副溶血弧菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio parahaemolyticus

圖2 K2-1發酵液對愛德華氏菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Edwardsiella

圖3 K2-1發酵液對哈維氏弧菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio harveyi

圖4 K2-1發酵液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Aeromonas hydrophila

圖5 K2-1發酵液對溶藻弧菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio alginolyticus

圖6 透析液和離心液的抑菌圈Fig. 6 Inhibition zone of dialysate and centrifugation.

2.3 抗菌物質部分特性分析結果

2.3.1 不同發酵時間對 K2-1菌株抗菌物質產量的影響

選用LB培養基, 在37 ℃, 180 r/min條件下發酵 4 h開始取樣, 以后每隔4 h取樣1次, 檢測發酵上清的抑菌活性和測定 K2-1的生物量, 結果如圖 7所示, 從圖中可以看出, 8 h出現抑菌活性, K2-1處于指數生長期, 發酵12 h抑菌活性達到最強, K2-1進入平臺期, 隨著發酵時間的延長, 抑菌活性逐漸減弱, 當發酵時間到達24 h時, K2-1進入衰亡期, 發酵上清的抑菌活性也逐漸減弱, 表明K2-1發酵過程生物量與發酵上清抑菌活性存在正相關。

圖7 不同發酵時間對K2-1菌株抗菌活性及生物量的影響Fig. 7 Effect of fermentation time on the antibacterial activity and biomass of strain K 2-1

2.3.2 不同溫度處理對發酵上清中抗菌物質活性的影響

選用LB培養基, 在37 ℃、180 r/min條件下發酵 15 h, 所得發酵上清分別在溫度為40、50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋中水浴加熱10 min后檢測抑菌活性, 結果如圖8所示, 在50 ℃保持較好的抑菌活性, 60 ℃時抑菌活性開始下降, 70 ℃時抑菌活性有明顯下降, 90 ℃時無抑菌活性, 結果表明抗菌物質具有一定的耐熱性。

圖8 不同溫度處理對K2-1發酵上清抗菌活性的影響Fig.8 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.3 pH值對 K2-1發酵上清中抗菌物質活性的影響

選用LB培養基, 在37 ℃, 180 r/min條件下發酵 15 h, 所得發酵上清用HCl、NaOH調整pH值分別為： 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 處理 3 h后檢測抑菌活性, 結果如圖9所示, pH對K2-1發酵上清抑菌效果略有影響, 在酸性條件下抑菌效果略差, 但抑菌效果保持在較好的水平(抑菌圈均達到19.50以上)； 在中性或弱堿性的條件下抑菌效果最好, 隨著堿性提高, 抑菌效果也隨著下降, 顯示發酵上清中的抗菌物質, 耐酸堿能力較強。

圖9 pH對K2-1發酵上清抗菌活性的影響Fig.9 Effect of pH on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.4 不同紫外線照射時間對 K2-1發酵上清中抗菌物質活性的影響

選用LB培養基, 在37 ℃、180 r/min條件下發酵 15 h, 得發酵上清, 發酵上清在紫外線波長365 nm、距離10 cm下分別照射10、20、40、60 min后, 檢測抑菌活性, 結果如圖 10所示, 發酵上清中的抗菌物質對紫外線不敏感, 不同照射時間對抑菌效果影響差異不明顯(P＞0.01), 照射后的發酵上清仍保持較好的抑菌效果。

圖10 不同紫外線照射時間對K2-1發酵上清的抗菌活性的影響Fig. 10 Effect of UV treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.5 不同蛋白酶對 K2-1發酵上清中抗菌物質活性的影響

選用LB培養基, 在37 ℃、180 r/min條件下發酵 15 h, 得發酵液, 分別選取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4種酶濃度均為1 g/L)在37 ℃水浴條件下與發酵上清進行酶解反應4 h后, 在70 ℃下水浴30 min滅活各蛋白酶, 取出檢測抑菌活性。結果如圖 11所示, 可以看出, 發酵上清中的抗菌物質對胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶不敏感, 均保持較好的抑菌效果, 而對蛋白酶K敏感。

圖11 不同蛋白酶對K2-1發酵上清的抗菌活性的影響Fig. 11 Effect of enzymatic treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

3 討論

目前食品安全備受關注, 作為一類重要的生防細菌, 芽孢桿菌在水產養殖中廣泛使用, 也取得了很好的效果, 如芽孢桿菌能較好地降解亞硝酸鹽[13]；巨大芽孢桿菌SZ-3對污染水體中的亞硝酸鹽具有較強的降解效果[14]。另外研究表明某些芽孢桿菌在拮抗水產病原菌方面也有良好的效果, 如海洋生境枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LHB02發酵產物對海水養殖常見致病菌弧菌有很強拮抗能力[10]； 短小芽孢桿菌 X93菌株, 其胞外產物對病原弧菌、遲緩愛德華菌和嗜水氣單胞菌等水產上常見的主要致病菌具有很好的抑制效果[8]。蠟狀芽孢桿菌在植物病害防治方面有明顯的效果, 如蠟狀芽胞桿菌N5對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum)等多種細菌和黃綠青霉(Penicillium)、炭疽菌(Colletotrichum)等多種真菌均表現出較好的抑菌活性, 抑菌譜更廣[15]。本實驗室篩選到的蠟狀芽孢桿菌 K2-1 對大菱鲆養殖中常見的致病菌包括副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌都有很強的抑制作用, 顯示出較廣的抑菌譜。

抗菌活性物質的產生除了與菌體本身的特性外,還受到培養基、發酵時間、發酵溫度、pH值、接種量和裝瓶量等因素的影響。其中發酵時間的控制至關重要, 發酵時間過短, 抗菌活性物質產量少, 發酵時間過長, 抗菌活性物質也隨之降低。然而發酵時間也是影響發酵成本的主要因素之一, 當抗菌活性物質達到高峰時的發酵時間越短, 則成本越低。許多研究表明, 一般發酵時間在32 h以上抗菌活性物質才能達到高峰, 如健康刺參腸道的益生菌—枯草芽孢桿菌(菌種保藏號為 CCTCC M2010316), 發酵時間32 h抑菌效果最佳[16]； 交替單胞菌 YTW-10發酵時間36 h抑菌效果最佳[17]； 枯草芽孢桿菌B2發酵時間36 h抑菌效果最佳[18]； 枯草芽孢桿菌G發酵38 h抑菌效果最佳[19]； 拮抗鏈霉菌No.2發酵時間96 h抑菌效果最佳[20]。本實驗室所分離的蠟狀芽孢桿菌K2-1發酵時間 12 h, 抗菌活性物質達到高峰, 因此可以大幅度的降低發酵成本, 有利于該菌的開發利用。

蠟狀芽孢桿菌 K2-1發酵上清在 40～70 ℃下保持較好的抑菌效果, 對酸堿度有較強的耐受性, 以及對多數蛋白酶不敏感, 特別是對胃蛋白酶不敏感,提高了該菌株抗菌物質應用的可行性, 如制備成生物抗生素, 利用其抵抗胃蛋白酶和胃酸的特性, 給藥進入動物消化道, 用于動物腸炎的防治。

K2-1所具有的對大菱鲆致病菌較強的抑制作用,以及抗菌活性物質發酵生產時間較短, 耐受環境條件較強, 賦予了該菌株具有較好的開發應用前景,下一步, 本實驗室將開展K2-1的發酵條件優化及活性產物的分離提取制備研究, 并開發基于該菌株的微生物殺菌劑及生物抗生素。

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