冬季大亞灣微表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)與DNA指紋的日變化

馬長(zhǎng)江, 王朝暉, 楊 雪, 梁建新

(暨南大學(xué) 生態(tài)學(xué)系 水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510632)

海洋微表層是位于海洋與大氣之間的薄層(≤1000 μm), 與其他水層相比, 具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物性質(zhì), 同時(shí)也在海洋與大氣之間的熱量與氣體交換、顆粒循環(huán)及微生物圈上扮演著重要角色[1-4]。作為海洋與大氣之間相互作用的一個(gè)重要界面, 微表層對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽、有機(jī)化合物、重金屬以及微生物、浮游生物等均具有明顯富集作用[5-7]。微表層浮游植物的光合作用能改變海-氣物質(zhì)交換, 其群落結(jié)構(gòu)則對(duì)生物地化循環(huán)產(chǎn)生影響[8]。由于許多無(wú)脊椎浮游動(dòng)物依賴微表層浮游植物生存, 微表層浮游植物能對(duì)浮游動(dòng)物產(chǎn)生上行效應(yīng)[9]。

微表層位于水體表面, 直接與陽(yáng)光接觸, 水溫較高, 環(huán)境因子的日變化變動(dòng)劇烈[10-11], 浮游植物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)產(chǎn)生一定變化以適應(yīng)微表層特殊、多變的環(huán)境。本課題組前期研究結(jié)果顯示微表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)與水層具有一定差異, 耐高溫的藍(lán)細(xì)菌數(shù)量明顯增加[2,12]。Falkowska等[13]通過(guò)對(duì)南波羅的海微表層、次表層葉綠素 a含量的日變化研究得出, 太陽(yáng)輻射和紫外輻射能明顯抑制葉綠素 a含量,在正午及午后葉綠素 a的含量明顯降低。但是目前尚未有對(duì)微表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性日變化的研究報(bào)道, 本文通過(guò)對(duì)大亞灣大鵬澳海域微表層、次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)的日變化進(jìn)行分析,并利用PCR-DGGE技術(shù)研究了浮游植物DNA指紋圖譜, 以揭示微表層以及次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)的日變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 采樣位點(diǎn)的設(shè)置與樣品的采集

在大亞灣海域設(shè)置了 3個(gè)采樣位點(diǎn)(圖 1), 于2013 年 12 月 3 日清晨(6：00)、正午(12：00)、傍晚(18：00)采集了微表層和次表層水樣, 三個(gè)站位的微表層和次表層樣品分別以W1、W2、W3以及C1、C2、C3表示。微表層樣品的采集采用篩網(wǎng)法, 將孔徑為1.0 mm的不銹鋼網(wǎng)篩鑲在40 cm×50 cm的鋁框中, 將篩網(wǎng)取樣器水平?jīng)]入海面下, 然后輕輕提起, 將篩網(wǎng)垂直豎起, 附在網(wǎng)格上的水膜逐漸脫離網(wǎng)格, 微表層水樣流入樣品瓶中。重復(fù)此過(guò)程直至收集到所需的水樣體積, 取樣量除以取樣次數(shù)和篩板表面積可得微表層厚度(200 μm±10 μm)。次表層水樣用 5LWB-PM有機(jī)玻璃采水器采集離水面0.5 m的水樣。

圖1 大亞灣采樣點(diǎn)的設(shè)置Fig.1 Sampling stations in Daya Bay

采集微表層、次表層水樣500 mL, 用4%的福爾馬林固定, 經(jīng)沉淀濃縮至20 mL, 用于進(jìn)行浮游植物定性定量。采集水樣 3 L, 用 1.5%的魯格試劑固定,用孔徑1.2 μm的Millipore RTTP濾膜進(jìn)行抽濾, 濾膜保存于-20℃, 用于浮游植物總DNA的提取。

1.2 環(huán)境參數(shù)的測(cè)定

用ProPlus型YSI儀以及Digital Luxmeter ZDS-10W照度儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水溫、鹽度、溶解氧、電導(dǎo)率、pH值以及光照強(qiáng)度。

1.3 浮游植物的分析鑒定

浮游植物的定性定量分析是在萊卡 DMIRB顯微鏡下進(jìn)行, 取 0.1mL經(jīng)過(guò)固定濃縮的樣品, 根據(jù)海洋浮游植物分類學(xué)相關(guān)資料[14-15], 對(duì)浮游植物進(jìn)行定性定量分析, 大部分浮游植物鑒定至種, 不能確定的種類鑒定至屬。每個(gè)樣品至少觀察兩次, 計(jì)數(shù)100個(gè)以上細(xì)胞, 浮游植物細(xì)胞密度以個(gè)/L表示。

1.4 浮游植物總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

采用上海生工的 UNIQ柱式植物基因組提取試劑盒提取浮游植物總DNA, 經(jīng)Nanodrop 2000/2000C檢測(cè) DNA的濃度及純度, 用 1%的瓊脂糖凝電泳膠檢測(cè)提取效果后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?8S rDNA V3區(qū)片段, 用真核生通用引物對(duì)18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 上下游引物分別為 Euk1209f-GC(5'-CGCCCGGGGCGCGCCC CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')和Uni1392r(5'-ACGGGCGGTGTGTA C-3')[16], 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)在 Applied Biosystems verityTMPCR儀中進(jìn)行, 反應(yīng)體系為40 μL,包括 4 μL 10×反應(yīng)緩沖液、0.8 μL上、下游引物(10 μmol/L)、1.2 μL dNTPs(10 mmol/L)、0.6 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、模板量 1.5 μL, 最后以 ddH2O補(bǔ)足體積。本實(shí)驗(yàn)采用降落PCR, 反應(yīng)條件為94℃1 min, 94℃變性1 min, 65℃退火2 min, 72℃延伸2 min,共10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃)； 94℃變性7 min； 55℃退火 1 min, 72℃延伸3 min, 20個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7 min。用1%的瓊脂糖凝電泳膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 其目的片段大小為210 bp, 大小均一, 符合DGGE電泳擴(kuò)增范圍(200～600 bp)。

1.5 DGGE分析

在 Bio-Rad公司的 DcodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物(40 μL)進(jìn)行DGGE分析。條件為： 丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%, 變性梯度30%～70%(100%的變性劑濃度為 7 mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40%去離子甲酰胺), 先用100 V電壓電泳2 min, 然后再用100 V電壓電泳16 h, 緩沖液為1×TAE, 電泳結(jié)束后用SYBR GREEN I染色30 min, 用 Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000TM)進(jìn)行拍照。

1.6 計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

1.6.1 富集系數(shù)與富集率

微表層浮游植物的富集系數(shù)(Enrichment factor,EF)定義為微表層浮游植物細(xì)胞密度與同一站位次表層浮游植物細(xì)胞密度之比, 富集率則為富集系數(shù)大于1.0的樣品所占的百分比。

1.6.2 數(shù)據(jù)處理與分析

DNA指紋圖譜用Quantity one軟件進(jìn)行帶型分析, 條帶光密度值強(qiáng)度低于 0.05被排除。將浮游植物細(xì)胞密度進(jìn)行了自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換, 用SPSS19軟件采用組間聯(lián)接、平方Euclidean距離的度量方法對(duì)3個(gè)站位微表層、次表層樣品進(jìn)行聚類分析, 并對(duì)清晨、正午、傍晚及微表層與次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境參數(shù)的變化

由表 1可以看出, 光照強(qiáng)度遵循一天中由弱到強(qiáng)到弱的變化趨勢(shì), 微表層光強(qiáng)遠(yuǎn)高于次表層(P＜0.05), 由于采樣時(shí)間的不一致, 清晨最后采樣的St.3光照強(qiáng)度明顯高于其他兩個(gè)站點(diǎn), 而傍晚則以St.1的光強(qiáng)最高。三個(gè)站點(diǎn)水溫相近, 正午最高, 清晨較低, 為 18.8～20.3℃之間； 微表層的鹽度和電導(dǎo)率明顯低于次表層, 溶解氧含量明顯高于次表層,其余參數(shù)在微表層和次表層之間沒(méi)有明顯變化。

表1 大亞灣海域微表層和次表層水環(huán)境參數(shù)的日變化Tab.1 Daily changes of the environment parameters in the surface microlayer (SML) and subsurface water (SSW) from Daya Bay

2.2 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜清晰, 各站位不同時(shí)間浮游植物DNA指紋條帶基本相近, 同時(shí)又具有一定差異(圖2)。DGGE圖譜帶型圖則能更清楚地反映各站位DNA指紋條帶數(shù)以及優(yōu)勢(shì)種的分布規(guī)律(圖3), 其中傍晚?xiàng)l帶數(shù)最為豐富, 共有 41個(gè)條帶, 清晨和正午的條帶數(shù)分別為23條、28條。

在同一時(shí)刻樣品中的優(yōu)勢(shì)種和常見(jiàn)種基本上相近, 如條帶1、2、4、5、9、18是清晨樣品中的常見(jiàn)條帶, 在所有站位中均大量出現(xiàn)(圖 3A)； 正午樣品的DNA指紋較為豐富, 條帶4、7、14、15、20為常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)條帶(圖 3B)； 傍晚?xiàng)l帶更為豐富多元, 條帶2、4、6、13、25為常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)條帶(圖3C), 條帶16、19、23和27也在所有樣品中出現(xiàn)。樣品DNA指紋條帶數(shù)為 12～28條(圖 4), 微表層略高于次表層, 平均分別為18.8條和18.1條, 其中W2的條帶數(shù)較為豐富。傍晚?xiàng)l帶較為豐富, 為 19～28條, 平均為 22條, 明顯高于清晨與正午(P＜0.05)； 正午與清晨DNA 指紋條帶相近, 差異不顯著 (P＞0.05), 平均條帶數(shù)分別為17.8條和15.7條。

2.3 浮游植物群落結(jié)構(gòu)

在本次調(diào)查中, 共分析觀察到浮游植物 79種,微表層和次表層浮游植物種分別為61種、68種, 清晨、正午和傍晚觀察分別為 49種、61種、51種。每個(gè)樣品觀察到 26～40種, 其中微表層和次表層平均分布為32.3種和33.9種, 兩者之間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)； 清晨、正午和傍晚每個(gè)樣品所觀察到的種類數(shù)也沒(méi)有明顯差別(P＞0.05), 平均分別為30.8種、35.2種、33.3種。

硅藻是本次調(diào)查的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群, 優(yōu)勢(shì)硅藻主要包括角毛藻(Chaetocerosspp.)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、丹麥細(xì)柱藻(Leptocylindrus danicus)、菱形海線藻(Thalassionema nitzschioides)以及擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaspp.)等, 其中角毛藻的種類較豐富, 主要為扭鏈角毛藻(Chaetocerostortissimus)、洛氏角毛藻(C. lorenzianus)、扁面角毛藻(C. compressus)、窄隙角毛藻(C. affinis)等。優(yōu)勢(shì)甲藻主要為原甲藻類, 如反曲原甲藻(Prorocentrum sigmoides)和海洋原甲藻(P.micans)等。

圖2 大亞灣微表層和次表層浮游植物18S rDNA V3 區(qū)DGGE圖譜Fig.2 The DGGE fingerprints of V3 region of 18S rDNA of phytoplankton in the SML and SSW from Daya Bay

圖3 浮游植物DGGE圖譜分析帶型圖Fig.3 DGGE profiles of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

在一天的調(diào)查中, 浮游植物密度變化范圍在4.6×105～4.0×106個(gè)/L, 平均為 1.5×106個(gè)/L。浮游植物細(xì)胞密度的日變化不顯著(P＞0.05, 圖5), 清晨、正午和傍晚的平均細(xì)胞密度分別為1.2×106、1.6×106、1.6×106個(gè)/L； 微表層和次表層間差異也不顯著(P＞0.05), 平均細(xì)胞密度分別為 1.7×106個(gè)/L 和1.2×106個(gè)/L。本次調(diào)查中, 雖然正午和傍晚微表層浮游植物細(xì)胞密度高于次表層, 特別是 W3正午細(xì)胞密度明顯高于其余樣品, 但微表層和次表層之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

微表層和次表層浮游植物均以硅占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),硅藻所占比例均在98%以上。此外還有少量的甲藻,而其他類別的浮游植物甚少出現(xiàn)(圖 6)。整體來(lái)說(shuō),清晨 6： 00的樣品中硅藻百分比含量較高, 達(dá)到99.6%, 基本上沒(méi)有其他類別的浮游植物出現(xiàn)； 正午和傍晚甲藻出現(xiàn)的數(shù)量增加(圖 6A)。微表層硅藻的百分比含量也高于次表層(圖 6B), 甲藻和其他藻類在次表層百分比含量增加。

圖4 浮游植物DNA指紋條帶數(shù)的日變化Fig.4 DNA fingerprints of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

圖5 大亞灣微表層和次表層浮游植物總細(xì)胞密度的日變化Fig.5 Cell density of total phytoplankton in the SML and SSW from Daya Bay

2.4 浮游植物群落聚類分析

圖7為浮游植物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析圖, 清晨(圖 7A)、正午(圖 7B)和傍晚(圖7C)浮游植物聚類結(jié)果都可明顯看出St.1和St.2的微表層與次表層樣品分別聚集在一起, 而St.3則單獨(dú)成一類。在全天的浮游植物聚類中(圖 7D), 大部分站位的微表層和次表層樣品以較小的距離聚集成一大類, 但是 St.3的 5個(gè)樣品未與其余樣品聚在一起, 特別是 W3正午和傍晚樣品與其他樣品距離較遠(yuǎn)。結(jié)果說(shuō)明大亞灣海域微表層和次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)比較相近, 站位間的差異大于微表層和次表層之間的差異, 而且相對(duì)較為離岸的St.3與近岸的St.1和St.2差異較大。

2.5 微表層對(duì)浮游植物的富集作用

由表2可以看出, 微表層對(duì)總浮游植物、硅藻以及優(yōu)勢(shì)硅藻種類的富集系數(shù)均在1.0以上, 富集率均超過(guò)了 66.7%； 但是微表層僅在清晨對(duì)甲藻具有較高的富集作用, 在正午和傍晚均無(wú)富集作用。角毛藻、中肋骨條藻和丹麥細(xì)柱藻是大亞灣海域優(yōu)勢(shì)硅藻, 在所有樣品中均出現(xiàn), 它們對(duì)浮游植物總數(shù)的貢獻(xiàn)超過(guò)了 70%, 微表層對(duì)這三種優(yōu)勢(shì)硅藻均具有明顯的富集作用, 其中對(duì)中肋骨條藻和丹麥細(xì)柱藻的富集系數(shù)分別高達(dá) 4.20和 5.47, 富集率均為100%。

圖6 大亞灣海域各類別浮游植物的數(shù)量百分比組成Fig.6 The quantitative percentages of different groups of Phytoplankton

表2 大亞灣海域微表層對(duì)浮游植物的富集系數(shù)與富集率Tab.2 The enrichment factor (EF) and enrichment frequency (%) of the SML on phytoplankton

圖7 浮游植物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析Fig.7 Clustering dendrogam of sampling stations based on phytoplankton community

2.6 浮游植物種類與DNA指紋條帶的比較

圖8對(duì)浮游植物DGGE指紋條帶數(shù)以及顯微鏡下觀察分析的浮游植物種類數(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示, 所有站位樣品中, DNA指紋條帶數(shù)均低于顯微鏡下觀察分析得到的浮游植物種類數(shù), 并且正午和傍晚浮游植物種類數(shù)和DNA指紋條帶數(shù)較為豐富。微表層平均 DNA指紋條帶數(shù) 18.9條, 平均種類為32.3種； 次表層平均DNA指紋條帶數(shù)為18.1條, 平均種類33.9種, 條帶數(shù)僅為種類數(shù)的60%左右。

如果剔除數(shù)量上小于 0.1%的浮游植物種類數(shù),種類數(shù)仍高于 DNA 指紋條帶數(shù)(圖 8)； 如果剔除數(shù)量上小于 0.5%的浮游植物種類數(shù), 則指紋條帶數(shù)與優(yōu)勢(shì)種的種類數(shù)相近； 如果剔除了在數(shù)量上小于1%的浮游植物種類數(shù), DNA指紋條帶數(shù)高于優(yōu)勢(shì)浮游植物種類數(shù), 而且各樣品之間優(yōu)勢(shì)浮游植物種類數(shù)相差不大。DNA指紋條帶數(shù)、浮游植物種類數(shù)以及＞0.1%、＞0.5%、＞1%浮游植物優(yōu)勢(shì)種種類數(shù)的平均值分別為22條、33種、27種、16種、11種。

3 討論

與前期研究結(jié)果相近[2], 大亞灣浮游植物種類和數(shù)量均較為豐富, 一天調(diào)查分析中就鑒定出浮游植物 79種, 平均細(xì)胞密度為 1.5×106個(gè)/L。由于大亞灣地處亞熱帶海域, 冬季水溫較高, 同時(shí)臨近大亞灣和嶺澳兩個(gè)核電站, 溫排水的排放也致使大亞灣冬季水溫的上升[17], St.3由于更靠近核電站, 水溫均高于其他站位。有研究表明, 較高的水溫在冬季更有利于浮游植物的生長(zhǎng)[18], 本研究中 St.3細(xì)胞密度均高于其他兩個(gè)站位, 而前期研究也顯示大亞灣海域浮游植物密度幾乎在每年在冬季都出現(xiàn)高峰值[19]。

微表層被認(rèn)為是在海洋表面的一種親水性膠質(zhì)膜[20-21], 風(fēng)浪容易導(dǎo)致微表層膠質(zhì)膜的破裂, 使微表層與次表層產(chǎn)生混合[22]。在本研究中, 微表層和次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)較相近, 無(wú)顯著性差異(P＞0.05), 而且在聚類分析中同一站位或者相近站位會(huì)聚集在一起, 說(shuō)明大亞灣海域微表層和次表層浮游植物混合均勻。小型鞭毛藻類和硅藻被認(rèn)為是溫帶近岸海域微表層浮游植物的主要組成成分[9]。在本研究中, 硅藻也是大亞灣微表層和次表層的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種類, 而甲藻等鞭毛藻類則在微表層出現(xiàn)較少。

圖8 DNA指紋條帶數(shù)與浮游植物種類數(shù)的比較Fig.8 Comparison between DNA fingerprints and species richness of phytoplankton.

微表層對(duì)有機(jī)物、重金屬、營(yíng)養(yǎng)鹽、生物代謝物以及細(xì)菌、光合色素等具有很強(qiáng)的富集作用, 對(duì)某些物質(zhì)的富集系數(shù)甚至高達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)[23]。在本研究中,微表層對(duì)總浮游植物、硅藻以及角毛藻、中肋骨條藻、丹麥細(xì)柱藻等優(yōu)勢(shì)硅藻均具有明顯的富集作用, 而對(duì)甲藻沒(méi)有富集作用。分析其原因, 首先是因?yàn)榇髞啚澈Ｓ虻母∮沃参锸且粋€(gè)由硅藻占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的群落, 在以往的大量調(diào)查中硅藻的年均百分比含量均超過(guò)90%,而且常常形成冬季硅藻水華； 其次, 微表層中較高的營(yíng)養(yǎng)鹽以及光照強(qiáng)度也是其對(duì)小型硅藻產(chǎn)生富集作用的重要原因[23]； 此外本研究是通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察來(lái)分析浮游植物種類和數(shù)量, 可能有少數(shù)小型鞭毛藻類(＜10 μm), 由于體型過(guò)小, 在顯微鏡分析中被忽略。

雖然有文獻(xiàn)報(bào)道正午和下午高強(qiáng)度輻射以及紫外輻射能對(duì)微表層和次表層浮游植物的色素體產(chǎn)生傷害作用, 導(dǎo)致在正午和午后微表層和次表層葉綠素a含量的下降[13]。但在本研究中, 清晨、正午和傍晚浮游植物種類及數(shù)量沒(méi)有明顯差別(P＞0.05), 浮游植物日變化不明顯； DNA指紋條帶數(shù)也僅在清晨明顯較低(P＜0.05), 然而正午微表層對(duì)總浮游植物以及硅藻的富集系數(shù)較高。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于本次調(diào)查為冬季, 正午日照強(qiáng)度雖然也較高, 微表層光強(qiáng)達(dá)到820～1196 μE, 但由于其紫外強(qiáng)度較弱, 高強(qiáng)度日照時(shí)間較短, 尚未達(dá)到抑制浮游植物生長(zhǎng)的程度, 此外次表層正午甲藻數(shù)量的增加也在一定程度上說(shuō)明正午的高日照強(qiáng)度促進(jìn)了浮游植物的生長(zhǎng)。

大亞灣冬季浮游植物 DNA指紋條帶比較豐富,但是DNA指紋條帶數(shù)均遠(yuǎn)低于顯微鏡下觀察分析得到的浮游植物種類數(shù), 條帶數(shù)僅為種類數(shù)的 60%左右。一方面可能是因?yàn)樵诶肣uantity one軟件分析DNA指紋圖譜時(shí), 會(huì)將光密度值強(qiáng)度低于0.05的條帶剔除。另一方面可能是因?yàn)镈NA在PCR擴(kuò)增過(guò)程中, 一些稀有種類的 DNA含量少, 浮游植物優(yōu)勢(shì)種類對(duì)其產(chǎn)生屏蔽作用, 而且在電泳過(guò)程中容易發(fā)生共遷移現(xiàn)象[24]。在本調(diào)查中, 浮游植物群落均是由一種或者兩種硅藻占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 從而導(dǎo)致在PCR-DGGE分析中對(duì)其他非優(yōu)勢(shì)種的屏蔽作用相對(duì)更強(qiáng)。但是如果剔除數(shù)量上小于0.5%的浮游植物種類數(shù),指紋條帶數(shù)則與優(yōu)勢(shì)種的種類數(shù)相近, 結(jié)果說(shuō)明PCR-DGGE技術(shù)能較大程度地反映浮游植物優(yōu)勢(shì)種群的組成, 而對(duì)于相對(duì)含量較少的物種可能會(huì)由于優(yōu)勢(shì)種的屏蔽作用而被掩蓋, 對(duì)浮游植物種類的檢測(cè)靈敏度為優(yōu)勢(shì)度0.5%。此外尚需結(jié)合熒光定量PCR以及切膠測(cè)序等方法對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性定量分析。由此說(shuō)明PCR-DGGE技術(shù)在分析浮游植物群落結(jié)構(gòu)上具有一定的可行性, 但傳統(tǒng)的顯微鏡分析方法仍是浮游植物群落結(jié)構(gòu)研究中最為可靠的方法之一。

微表層的采樣有很多種方法[25-26], 包括玻璃板法(采集厚度 40～60 μm)、金屬篩網(wǎng)法(200～400 μm)、平滑采樣器(1 000～2 000 μm)以及轉(zhuǎn)筒采樣器(70～100 μm),取樣方法的不同, 所取得的樣品厚度也有所不同,可能會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[17]。但是研究顯示, 不同的采樣方法對(duì)芳香烴[25]及多氯聯(lián)苯類[26]在微表層的富集沒(méi)有明顯影響, 其中篩網(wǎng)法可以適應(yīng)不同的氣候條件, 是較為理想的微表層采樣方法[26]。在本研究中采用篩網(wǎng)法采集微表層水樣, 采集的是厚度為200 μm以內(nèi)的微表層水樣, 這部分微表層水樣中不僅包括浮游植物, 也包括了浮游細(xì)菌以及一些小型浮游動(dòng)物。此外, 風(fēng)浪也影響微表層膜的形成,風(fēng)速為5～10 m/s下對(duì)微表層影響不大, 但是超過(guò)12 m/s的風(fēng)速可以破壞微表層, 水華也可導(dǎo)致微表層的破壞[22]。大亞灣屬于半封閉內(nèi)灣, 風(fēng)浪較小, 在沒(méi)有降雨和藻華的情況下微表層應(yīng)保存完好。

4 結(jié)論

1) 大亞灣海域浮游植物種類、數(shù)量以及 DNA指紋均較豐富, 硅藻占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)； 清晨、正午和傍晚浮游植物種類和數(shù)量無(wú)明顯差異, 浮游植物群落結(jié)構(gòu)日變化不明顯。

2) 雖然微表層與次表層浮游植物群落結(jié)構(gòu)相近,但微表層對(duì)浮游植物具有較好的富集作用, 對(duì)硅藻以及優(yōu)勢(shì)硅藻種類的富集作用較為明顯, 其中對(duì)中肋骨條藻及丹麥細(xì)柱藻的富集率高達(dá)100%, 而對(duì)甲藻的富集作用卻不明顯。

3) 傳統(tǒng)的顯微鏡分析方法仍是浮游植物群落結(jié)構(gòu)研究中最為可靠的方法之一, 但是一些微微型浮游植物很難在顯微鏡下準(zhǔn)確鑒定, PCR-DGGE技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地反映數(shù)量百分比在0.5%以上的浮游植物優(yōu)勢(shì)種的DNA指紋圖譜。

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