藻藍蛋白抗氧化作用及其藥理活性研究進展

夏 冬 , 孫軍燕 , 劉娜娜 劉 冰 杜振寧

(1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源利用所重點實驗室, 山東 煙臺 264003; 2. 煙臺大學 藥學院, 山東 煙臺 264005)

藻藍蛋白(Phycocyanin, 簡稱 PC, 吸收光譜615～640 nm)是一類普遍存在于藍藻中具有光合作用的捕光色素蛋白[1]。藻藍蛋白具有眾多的藥理活性,如抗炎、抗腫瘤、抗過敏、維持機體穩態以及減毒增效等[2], 藥理試驗證明其對機體內自由基代謝紊亂具有顯著的調節作用。自由基參與很多疾病的發生過程, 包括: 炎癥, 動脈粥樣硬化, 癌癥, 再灌注造成的損害及氧化脅迫引起的其他機能障礙等[3]。本文對藻藍蛋白的抗氧化活性和藥理效果進行梳理,推論了藻藍蛋白的藥效活性和抗氧化機理的關系,為藻藍蛋白的藥理學研究提供參考。

1 藻藍蛋白的結構與功能

藻類可利用自身的捕光色素復合體的桿狀結構來捕光, 色素復合體中含有數千個捕光色素分子,可幫助海藻吸收極微弱的陽光。 鈍頂螺旋藻藻膽體的藻藍蛋白(C-Phycocyanin, C-PC)和別藻藍蛋白(Allophycocyanin, APC)通過連接蛋白非共價地交聯在一起, 能量從CPC傳到 APC, 最后傳到光合作用反應中心以推動光合作用的進行[4]。藻藍蛋白的抗氧化作用與其特有的結構有關(圖1)。藻藍蛋白中捕光色素、色氨酸殘基與色基間存在著激發能傳遞現象[5],具有從基態到激發態轉變的能力, 具有傳遞電子的能力傳遞, 包含了氧化還原的過程。

另外, Stocker 等[7]研究表明, 膽紅素具有消除過氧化物自由基的作用, 其機理是膽紅素可將過氧自由基綁定到C-10位的四吡咯分子的一個氫原子上,使自由基與中心碳原子形成共振穩定, 最終擴展到整個膽紅素分子。藻藍蛋白的發色團(藻藍素)中開放的四吡咯鏈(如圖 2A)與膽紅素(如圖 2B)非常相似,或為其抗氧化活性做出貢獻。

圖1 藻膽體的基本結構[6]

圖2 藻藍蛋白發色團(A)和膽紅素(B)的常見結構[8-9]

Romay[10]首先報道了藻藍蛋白的抗氧化的特性,其評價了藻藍蛋白在體內外作為抗氧化劑的潛力,實驗結果顯示藻藍蛋白能夠有效消除羥基自由基和烷氧自由基, 表明藻藍蛋白具有在體內外作為抗氧化劑的潛力。Halliwell[11]研究發現, 藻藍蛋白對肝微粒體脂質過氧化也有抑制作用, 該實驗中超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化能力比藻藍蛋白高3倍, 而增加 SOD 的量, 卻沒有改變藻藍蛋白的抗氧化能力,表明它們存在不同的抗氧化作用機制。另外, 藻藍蛋白的抗氧化機理與常用的抗氧化劑如生育酚和抗壞血酸類似, 可以抑制2, 2-偶氮二(2-瞇基丙烷)二鹽酸鹽引起的紅細胞溶血[12]。Hirata等[13]研究了藻藍蛋白對疏水系統的亞油酸甲酯和磷脂酰膽堿脂質體模型的抗氧化作用。該實驗表明, 每摩爾的藻藍素(藻藍蛋白的一個組成部分)的抗氧化活性高于同等摩爾量α-生育酚。并且, 從噴霧干燥的螺旋藻中提取的藻藍蛋白與從新鮮螺旋藻提取的藻藍蛋白具有類似的抗氧化活性。因為在干燥過程中藻藍蛋白的部分脫輔基蛋白會發生變性, 這些結果表明藻藍蛋白的藻藍素對其抗氧化能力具有重要貢獻。該研究顯示藻藍蛋白具有較好的抗氧化活性, 干燥后的藻藍蛋白由于穩定性較好, 所以在商業開發上具有重要的利用價值。

2 藻藍蛋白抗氧化活性與相關藥理活性

2.1 藻藍蛋白抗氧化活性與抗炎作用

首先, 藻藍蛋白可以抑制魯米諾在堿性條件下的氧化發光反應[14], 作用于吞噬細胞呼吸爆發, 使自由基(·OH, H2O2, RO·)和多余過氧化物減少, 從而達到抑制作用。有證據[15]表明活性氧如超氧陰離子,過氧化氫和羥基自由基, 可以使花生四烯酸級聯,從而造成肥大細胞脫顆粒并釋放組胺、5-羥色胺、腫瘤壞死因子和其他炎癥介質。而藻藍蛋白正好能夠清除過氧化物, 羥基和烷基自由基。Spillert等[16]為了了解藻藍蛋白對 H2O2和·OH潛在的清除能力, 研究了其對過氧化氫誘導的體外炎癥反應模型的抑制作用。結果顯示, 藻藍蛋白減輕了葡萄糖氧化酶在小鼠爪子上引起的水腫。因此, 藻藍蛋白對·OH的清除效果使它具有了抗炎作用。在相同的劑量范圍內, 藻藍蛋白在角叉菜膠誘導的大鼠后爪水腫和大鼠的棉花小球肉芽腫實驗中均具有抗炎活性[17]。藻藍蛋白能顯著降低花生四烯酸介導的小鼠耳水腫以及角叉菜膠誘導的大鼠足跖浮腫, 歸因于對活性氧的清除和對花生四烯酸代謝的抑制。Gonzalez和 Fretland等[18-19]將藻藍蛋白作用于醋酸誘導的潰瘍性結腸炎的動物模型, 通過分析結腸組織以及測定髓過氧化物酶活性, 結果表明, 給予藻藍蛋白的受損動物結腸炎模型的結腸黏膜中, 嗜中性粒細胞浸潤顯著減少, 顯著降低產生自由基和多種反應性物質誘發疾病的髓過氧化物酶活性, 證實藻藍蛋白能有效降低乙酸造成的大鼠結腸炎發生率, 抗炎機理和其抗氧化活性有關。

2.2 藻藍蛋白抗氧化活性與保護肝臟的作用

Bhat等[20]研究了藻藍蛋白對用 R-(+)-長葉薄荷酮和CCl4誘導的大鼠肝毒性藥理活性。結果顯示藻藍蛋白可以顯著降低兩種化合物產生大量自由基引起的肝毒性。2002年, Remirez等[21]研究了藻藍蛋白對肝臟枯否細胞氧化應激的相關參數影響。結果顯示, 藻藍蛋白顯著降低了枯否細胞的吞噬功能和相關的呼吸爆發活動, 其原理是藻藍蛋白減少了氧化應激產生的腫瘤壞死因子TNF-α和甲亢狀態下產生的一氧化氮。所以我們認為, 藻藍蛋白的保肝作用主要歸功于其抑制了氧化反應中活性代謝產物的生成以及有效的消除自由基。此外, 藻藍蛋白還可以抑制細胞色素P450介導的一些反應, 例如, 抑制P450參與的氧化反應活性代謝物的生成。Bhat等[22]也證實了藻藍蛋白可以抑制由CCl4誘導的大鼠體內肝臟脂質過氧化反應。

2.3 藻藍蛋白抗氧化作用與消除白內障作用

Ou等[23]發現藻藍蛋白通過線粒體和未折疊蛋白反應途徑抑制 D-半乳糖誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡。晶狀體上皮細胞凋亡是白內障形成的重要原因, 預防 LEC細胞凋亡可以作為白內障的一種治療策略。Kumari等[24]又研究了藻藍蛋白對由亞硒酸鈉誘導的大鼠白內障的調節作用。實驗結果表明藻藍蛋白可以通過調節體內外抗氧化酶的水平, 以致減少體內氧化應激反應, 降低了亞硒酸鈉誘導的白內障的發病率。

2.4 藻藍蛋白抗氧化活性與保護血管作用

Ross[25]于1999年提出動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病, 具有慢性炎癥反應病理過程的特征。Riss等[26]實驗證實螺旋藻中的藻藍蛋白通過抑制活性自由基和環氧合酶-2的生成, 從而提高了體內抗氧化酶的水平, 有效改善了動脈粥樣硬化動物氧化應激所造成的炎癥損傷, 并具有調節血脂的作用。由于動脈粥樣硬化病變的形成是動脈對內膜損傷做出炎癥-纖維增生性反應的結果, 褚現明等[27]通過體內外實驗, 研究了鈍頂螺旋藻藻藍蛋白對血管平滑肌細胞過度增殖、血管損傷后內膜增生和管腔狹窄的抑制作用和機制。證實藻藍蛋白可以通過抑制細胞 G1/S周期進程, 抑制VSMCs的過度增殖及新生內膜的形成, 從而降低血管氧化炎癥損傷, 明顯抑制管腔狹窄, 因此證明了藻藍蛋白抗氧化活性對血管健康具有良好的保健預防作用。Strasky等[28]研究了藻藍蛋白對血紅素加氧酶-1的激活作用, 這種酶可以使血紅素分解代謝產生強效的抗氧化膽紅素。實驗結果顯示, 螺旋藻中的藻藍素能夠減少氧化應激反應, 在內皮細胞中激活HMOX1, 造成載脂蛋白E基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化病變中增加HMOX1的表達。這也為藻藍蛋白降低血管粥樣硬化提供了新的理論依據, 即增加血紅素加氧酶-1的表達來增加抗氧化效果。

2.5 藻藍蛋白抗氧化活性與神經保護作用

抗氧化能力的下降和氮氧活性自由基的增加與人體器官老化和神經退行性疾病有很大關聯[29-31]。在某些動物模型中注射 SOD, 發現其可以抑制這些模型的炎癥反應, 在離體免疫細胞以及動物和人類體內, 可以增加免疫功能的某些分子表達[32]。許多臨床試驗報告表明, 在腦損傷或梗死的患者的腦脊液和腦組織中, 細胞因子的表達明顯增加[33-34]。藻藍蛋白的抗氧化性可能作用在細胞因子上, 從而及時修復腦損傷, 抑制細胞壞死。

Rimbau等[35]研究發現, 藻藍蛋白可以減少在大鼠海馬區紅藻氨酸誘導的癲癇反應, 具有保護神經元的作用。紅藻氨酸導致癲癇是因為其生成了大量氧活性自由基, 藻藍蛋白通過減少自由基起到對神經元損傷的保護作用。該實驗提示藻藍蛋白可以用于治療神經退行性疾病中的氧化應激誘導的神經元損傷, 如阿耳茨海默氏病和帕金森綜合癥等。另外,Rimbau等[36]還發現, 藻藍蛋白通過減少氧自由基來保護體外鉀和血清缺乏培養的大鼠小腦顆粒細胞的死亡。Marin等[37]實驗證明, 藻藍蛋白可以保護SH- SY5Y神經細胞免受氧化損傷, 減少大鼠視網膜短暫性腦缺血和大鼠腦線粒體內Ca2+/磷酸鹽引起的功能損傷。

2.6 藻藍蛋白抗氧化活性與腎肺器官的作用

Shukkur等[38]實驗發現藻藍蛋白能夠預防由草酸在犬腎細胞觸發氧化應激介導的細胞損傷, 降低細胞中草酸誘導的活性氧(ROS)和脂質過氧化(LPO)反應, 對線粒體膜通透性具有顯著的保護作用。Zheng等[39]發現螺旋藻藻藍蛋白和藻藍素可以通過抑制氧化應激、從而達到預防糖尿病腎病的發生。口服 10周藻藍蛋白可以防止二型糖尿病小鼠(db/db小鼠)出現蛋白尿和腎系膜擴張, 使腫瘤生長因子-β和纖維連接蛋白表達正常化, 使腎臟中氧化應激標記物NADPH氧化酶表達降低。另外, 在Gonzalez等[40]的試驗中, 藻藍蛋白與卡那霉素合用可以減少大小鼠腎小管血管充血和炎癥浸潤, 降低卡那霉素這種氨基糖甙類抗生素所造成的腎毒性。Sun等[41]實驗證明藻藍蛋白可以提高肺組織(SOD)和血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性, 降低肺組織羥脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)和血漿MDA含量, 減輕百草枯中毒大鼠肺泡炎及后期纖維化程度, 對百草枯誘導的大鼠肺泡炎及肺纖維化具有顯著的抑制作用。

2.7 藻藍蛋白抗氧化活性與預防腫瘤作用

鄰苯三酚紅漂白實驗[42]結果顯示, 藻藍蛋白輔基比藻藍素對過氧亞硝基陰離子有更強的清除作用,而藻藍素也很顯著的抑制了過氧亞硝基陰離子造成的 DNA單鏈斷裂, 并呈劑量依賴關系, 這種效果可能為預防細胞發生癌變打下了基礎。Gupta等[43]研究了藻藍蛋白對暴露于12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)的小鼠皮膚腫瘤基因的保護作用。當TPA誘導的小鼠出現腫瘤關鍵特征因子, 如鳥氨酸脫羧酶, 環氧合酶-2,白細胞介素 6和磷酸化信號轉導及轉錄活化因子 3的表達時, 使用藻藍蛋白可抑制這些由 TPA引起的腫瘤關鍵特征因子的表達, 并且具有劑量依賴性。Thangam 等[44]對藻藍蛋白的抗氧化和抑制癌細胞生長進行了研究。通過熒光和相差顯微鏡觀察到藻藍蛋白可抑制HT-29(結腸癌)和A549(肺癌)細胞的生長,使癌細胞的DNA在G(0)/G(1)期停滯和裂解。

另外, 藻藍蛋白對于化療過程中產生的機體氧化應激損傷的良好保護能力。Fernandez等[45]研究了藻藍蛋白對順鉑導致的腎毒性的作用, 結果顯示,藻藍蛋白可以防止順鉑引起的谷胱甘肽還原酶的降低, 減少過氧化氫的含量, 維持血液中尿素氮的水平, 對氧化應激有良好的抑制作用, 具有抑制順鉑所致的腎毒性的作用。不僅如此, 多年癌癥研究證明,恰當的藥物的組合可以有效的提高單一藥物在治療方案中的安全性和有效性[46]。1998年, 辛華雯等[47]研究了藻藍蛋白對氨甲喋呤和順鉑的體外增效作用。結果顯示, 藻藍蛋白與氨甲蝶呤合用后顯著增強后者的細胞毒性, 隨著氨甲蝶呤濃度的提高, 其增效作用也增強, 無藻藍蛋白與加用藻藍蛋白的細胞存活率之間存在高度顯著性差異, 其與現有增效劑維拉帕米(鈣離子通道抑制劑)相比, 效果相近但毒性更小。Miroslav等[48]用 10%的常規劑量的拓撲替康與藻藍蛋白聯用, 效果比單用常規劑量的拓撲替康效果更好, 激活了大量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。在提高拓撲替康的效果的同時降低其副作用的發生。Saini等[49]也在同年證實了傳統的非甾體抗炎藥吡羅昔康和藻藍蛋白聯合用藥, 效果比單用提高 70%以上, 環氧合酶 2(COX-2)表達和前列腺素 E2 (PGE-2)水平大大降低,DNA斷裂也被抑制。不難看出, 藻藍蛋白的抗氧化作用起到了提高免疫力和保護受損器官的作用, 而藻藍蛋白作為一種光敏劑與現有臨床抗癌藥物的聯用將會在化療的增效方面起到重要的作用。

3 總結與展望

本實驗室對重組別藻藍蛋白的抗氧化活性研究[50-51]表明, 重組別藻藍蛋白具有清除自由基的能力, 但其對不同類型自由基的清除效果有較大差別。由于藻藍蛋白結構組成與別藻藍蛋白相類似, 藻藍蛋白的輔基蛋白也具有類似的抗氧化活性[52]。隨后進一步驗證藻藍素(phycocyanobilin, PCB) 對DPPH自由基的清除作用呈現一定的量效關系[53]; Pleonsil等[54]的最新研究結果顯示, 天然藻藍蛋白的抗氧化活性大于重組藻藍蛋白。藻藍蛋白的抗氧化活性, 藻藍色素起到了一部分作用[13], 而輔基蛋白也應具有與藻藍素不同途徑的抗氧化作用[52], 間接證實了藻藍蛋白是從脫輔基蛋白和藻藍素兩個水平上清除自由基的。

當今，我們已經可以通過比較成熟的化學和生物工程技術得到純度較高的藻藍蛋白。但活性會隨著原料和提取工藝的不同而出現差別。藻藍蛋白擁有了良好的抗氧化能力可以為申請保健品和候選藥品打下基礎，成功與否取決于其自身良好的品質控制。傳統開放式養殖獲取藻藍蛋白需要大量的條件摸索達到品質恒定，而工業化的生物重組表達較為可控，但藻藍素很難能夠通過生物工程裝配到多聚體的蛋白亞基上，其得到藻藍蛋白活性和品質還需進一步研究。另外，藻藍蛋白代謝產物和衍生物較為復雜。通過口服和注射等給藥途徑，確定藻藍蛋白的活性效果是由整體還是由它的代謝產物起到的，是我們接下來所要研究的目標。文中提到了藻藍蛋白可以在不同的疾病器官中發揮抗氧化作用，藻藍蛋白是如何進入細胞，又如何發揮作用是研究的關鍵。螺旋藻的大規模的養殖為藻藍蛋白開發利用奠定了基礎，其功能性食品為其應用進行了探索。因此，未來藻藍蛋白活性與機制的深層研究和臨床試驗將為其應用開辟更大的空間。

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