抑制素α-亞基成熟區基因在大腸桿菌中的原核表達

薛琳琳（黑龍江省雙城市黑龍江職業學院 150111）

抑制素α-亞基成熟區基因在大腸桿菌中的原核表達

薛琳琳（黑龍江省雙城市黑龍江職業學院 150111）

本試驗成功獲得抑制素α-亞基編碼序列的克隆載體后，從陽性細菌中提取質粒，經SacI和XhoI酶切，回收354bp目的片段，與表達載體pET-32a連接，將構建好的pET32a（+）-INH-α原核表達質粒轉化到受體菌E.coli BL21（DE3）中，經IPTG誘導后，Tricine-SDS-PAGP電泳鑒定，檢測到仔鵝與東北白鵝抑制素-α成熟區基因的表達。

抑制素；α-亞基；原核表達；試驗

1 材料與主要試劑

仔鵝與東北白鵝的抑制素α-亞基（INH-α）編碼序列的克隆載體、BL21（DE3）大腸桿菌和表達載體pET-32a Vector，均由黑龍江八一農墾大學分子生物學實驗室保存。

低分子量標準蛋白Marker：大連寶生物有限公司；T4 DNA Ligase：大連寶生物有限公司；IPTG、DMSO：大連寶生物有限公司；三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine），Tris堿，SDS：鼎國試劑有限公司；甘油，巰基乙醇、PEG、DTT為國產分析純試劑。

2 方法

2.1 仔鵝和東北白鵝抑制素α-亞基成熟區基因原核表達載體的構建

2.1.1 重組克隆載體的酶切消化

使用限制性內切酶SacI和XhoI同時雙酶切重組克隆質粒pMD18-TSimple-INHα和pET-32a質粒，并回收目的片段。

2.1.2 酶切產物的連接

將目的片段與表達載體pET-32a連接。連接體系見表1。

表1 目的基因與質粒載體的連接反應體系

將連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，取100μl轉化產物涂布在含Amp（60μg/ml）的LB平板上，倒置培養，于37℃培養，12～16h后可出現菌落。挑取單個菌落（2～3mm直徑）接種于含Amp（50μg/ml）的LB液體培養基中，37℃置于搖床（200rpm/min）培養過夜，試劑盒法提取質粒。

將所提取的質粒DNA在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察結果，選取質粒進一步進行PCR擴增和限制性內切酶消化分離DNA片段鑒定。

2.1.3 重組質粒的鑒定

擴增體系按照表2質粒PCR體系操作，將重組質粒進行雙酶切。將PCR擴增和雙酶切鑒定正確的重組質粒送上海生物工程有限公司進行序列測定。

表2 質粒PCR擴增體系

PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個循環；72℃后延伸10min。

2.2 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達

對表達菌株分別用不同濃度的IPTG（終濃度0.5、1、2、4、8mmol/L）和不同誘導時間（1、2、3、4、5h）進行表達條件的優化。

2.3 表達產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Trision-SDSPAGE）檢測

鑒定為陽性的菌液，經IPTG3.5h誘導后，進行Trision-SDS-PAGE電泳[1，2]。

3 結果與討論

（1）經PCR擴增和雙酶切鑒定，如圖1所示，結果在約354bp和5900bp處見到明顯的條帶，與預期目的帶大小相符。

圖1 酶切鑒定表達載體重組質粒pET32a-INH-α

（2）取超聲波破碎處理的誘導菌液沉淀和上清進行Trision-SDS-PAGE分析。結果如圖2，融合蛋白大部分以包涵體的形式存在，在32.8kDa位置有一明顯符合預期大小的條帶。

圖2 包涵體的鑒定

（3）加入IPTG誘導1～5h后，經Trision-SDS-PAGE分析，通過Imagemaster totallab v1.11軟件進行凝膠自動掃描分析，融合蛋白的表達量約占菌體總蛋白的28.96%。在約3.5h達到最大表達量，如圖3。

圖3 INH-α基因在大腸桿菌中的誘導表達

4 結論

構建了仔鵝和東北白鵝INH-α亞基成熟區cDNA的原核表達載體pET32a（+）-INH-α，為進一步進行鵝INH-α亞基的真核表達打下重要的理論基礎、提供重要的參考數據。

將構建好的ET32a（+）-INH-α原核表達質粒轉化到受體菌E.coli BL21（DE3）中，經IPTG誘導后，Tricine-SDSPAGP電泳鑒定，檢測到INH-α外源基因的表達。而且，本研究構建的融合蛋白表達量很高（約占菌體總蛋白的30%），是一種較實用的原核表達系統。

[1]曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGP分離方法.生物學通報[J].2003,38（3）:55-56.

[2]J Sambrook,DW Russell.Expression of cloned genes in E.coil using the bacteriophage T7 promoter[M].Molecular cloning,a laboratory Manual,third edition.2001,Cold Spring Harbor Laboratory Express,New York.Pp15.20-15.24.

薛琳琳（1980-），女，碩士，副教授，主要從事家禽飼養繁育及動物解剖生理教學及科研工作。