一個兒童早老癥家系臨床特征分析和致病基因研究

覃霞 羅彥彥 袁廣之 暢榮妮 賴青鳥 楊益金 華榮 李福記 方玲 吳華裕 馬軍 胡啟平 李曉龍 袁志剛 林有坤 舒偉

·研究報道·

一個兒童早老癥家系臨床特征分析和致病基因研究

覃霞 羅彥彥 袁廣之 暢榮妮 賴青鳥 楊益金 華榮 李福記 方玲 吳華裕 馬軍 胡啟平 李曉龍 袁志剛 林有坤 舒偉

目的 通過對一個罕見早老癥家系的分析，探討早老癥患者的臨床病理學特征和遺傳學因素。方法 收集1個早老癥家系（2代共5名家庭成員，子女3人均為患者）3例患者的基本資料，對其進行臨床檢查，并對患者手部、肺臟和下頜骨進行影像學分析；同時對3例患者進行染色體核型分析，對該家系進行LMNA基因突變分析。結果 家系中的3例患者半歲左右即可見皮膚硬化癥，并表現出生長嚴重遲緩，極度衰老面容。年長患者影像學檢查顯示骨質疏松，下頜骨發育不全。染色體核型分析顯示，3例患者及其父母核型正常。基因突變分析顯示，3例患者均為LMNA基因第9號外顯子的純合突變1579C＞T（R527C），父母均為LMNA R527C雜合突變。結論 該早老癥家系患者符合兒童早老癥表型，為LMNA基因R527C純合突變所致。

早衰；LMNA基因；DNA突變分析；Hutchinson-Gilford綜合征

兒童早老癥也稱為漢氏早老綜合征（Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS,OMIM,176670），是一種極為罕見、以過早老化為特征的疾病［1］。高加索人較其他人種更易患早老病，達到該病例報道的97%［2］。有文獻報道HGPS為常染色體顯性遺傳病，也有極少數文獻報道為常染色體隱性遺傳病［3-6］。研究表明，將近90%的HGPS是由定位于1q21.2上的LMNA基因的 11 號外顯子發生點突變（G608G：GGC→GGT）引起［7］。本研究對我國發現的一個隱性遺傳早老癥家系進行了臨床特征分析，并研究了該家系的致病基因及其突變位點。

一、對象

獲得患者父母知情同意。該HGPS家系來自廣西壯族自治區賀州市，漢族，先證者為7歲女孩，2009年就診于廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚科。家系2代共5名家庭成員，子女3人均為患者，父母為非近親婚配。家系中雙親表型正常。

二、研究方法

1.染色體G顯帶：抽取3例患者外周血2ml，用抗凝管保存。送至廣西壯族自治區人民醫院生殖中心進行染色體G顯帶分析。

2.外周血DNA抽提：在簽署知情同意書的前提下抽取該家系5名成員外周靜脈血各3ml，EDTA抗凝。外周血使用常規苯酚、氯仿抽提白細胞基因組DNA。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA的完整性，微量紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。DNA無降解、A260/280介于1.8～2.0之間為合格樣品。根據所測濃度，用1×TE緩沖液稀釋DNA樣本至終質量濃度為50 mg/L，置于-20℃保存。

3.LMNA基因的突變分析：根據NCBI中LMNA基因序列，利用NCBI在線引物設計軟件Primer-BLAST得到LMNA基因12個外顯子相關引物序列（9號外顯子上游引物5′-CAGGTGGTGACGGTGAGTG-3′，下游引物 5′-TCTAGAAAGG GGCCCTGAAT-3′，11 號外顯子上游引物 5′-AGTGGTCAGTC CCAGACTCG-3′，下游引物 5′-CCTGCAGGATTTGGAGACA-3′），所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以家系中5名成員外周血提取的DNA為模板進行PCR擴增，使用美國Bio-RAD公司的T100 Thermal CyclerPCR儀進行PCR反應，反應體系為：2×Taq PCR Master Mix（羅氏公司）25μl，下游引物各 1μl，DNA 模板 1μl；水 22μl，總體系為50μl。反應條件為第1步94℃2min；第2步（29個循環）94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；第3步 72℃ 5min后可設置4℃保存。2%瓊脂糖電泳鑒定產物特異性后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。測序結果用Chrome軟件分析測序峰圖，Clustal 1.83軟件進行序列比對，尋找可疑突變。

圖1 兒童早老癥家系患者臨床特征 1A：先證者（Ⅱ1）典型早老面容，同時有斜頸；1B：先證者（Ⅱ1）雙手皮膚硬化，雙手指遠端萎縮，肢端溶解；1C：先證者妹妹（Ⅱ2）典型的早老面容，禿頂，尖鼻，小下頜；1D：先證者妹妹（Ⅱ2）雙下肢皮膚硬化，足背皮膚呈瘢痕狀萎縮

三、結果

1.患者基本資料和表型特征：3例患者的發病過程基本一致，均于1歲內發病。先證者7歲，身材矮小（身高95 cm，9 kg），頭圍45.4 cm，禿頭，眼球突出，眉毛、睫毛稀疏，小下頜，牙擁擠，斜頸。全身皮下脂肪萎縮，皮膚薄，干燥緊縮，頭皮及雙下肢淺靜脈顯露。四肢皮膚硬皮病樣改變，指趾骨攣縮，指甲蒼白。曳行步態，關節活動度下降。先證者之妹妹4歲，身高77 cm，體重8 kg，頭圍44.4 cm，全部牙齒均患齲病，除無斜頸外，其余特征與先證者類似（圖1）。先證者之弟弟1歲，出生后6個月頭發便開始脫落，頭皮靜脈顯露，皮層變薄，雙下肢皮膚為硬皮病早期改變。3例患者智力和性格均無異常。家族中未發現其他遺傳病史。

2.臨床檢查：先證者2009年就診時發現血小板升高，D-二聚體定量檢測為203 mg/L。雙膝關節平片未見異常，左腕部腕骨骨化中心出現2枚，骨質未見異常。左手遠節指骨發育細小［8］。此次檢查發現，先證者游離脂肪酸為2 372μmol/L，骨堿性磷酸酶132 U/L，血清磷1.83 mmol/L，肌酸激酶219 U/L，D-二聚體定量為426 mg/L，尿素肌酐比為0.219。其他2例患者此次檢查結果在與先證者基本相同，而家系中父母血清學指標則正常。

3例患者的雙手正側位X線片均提示骨質疏松及指骨遠端骨質缺損，先證者有骨齡發育遲緩，右側胸鎖乳突肌發育不良導致斜頸，且有明顯的小下頜，顱蓋骨與下頜骨比例失調，軀干瘦小。其他檢查如甲狀腺激素、生長激素、電解質則在正常范圍內。肺部CT未見明顯病變。心電圖、心臟彩超、眼底血管檢查也未見異常。

3.家系致病基因分析結果：該家系中父母表型正常，子女3人均患病，符合常染色體隱性遺傳特征。3例患者染色體核型分析顯示，先證者及其妹妹均為46，XX，先證者之弟弟為46，XY，G帶分析均未見異常。

家系成員外周血基因的雙向測序結果用Chrome軟件分析測序，用Clustal 1.83軟件與NCBI獲取的標準序列序列比對，發現3例患者均為R527C純合突變；患者父母為攜帶者，均為LMNA基因第9號外顯子R527C雜合突變（圖2）。

圖2 早老癥家系5名成員LMNA C.1579T突變 攜帶者即為患者父母，患者即為3例早老兒童，箭頭所指即為LMNA基因上的突變位點

四、討論

早老癥主要表現為生長發育遲緩，身材矮小，體重輕，頭大臉小，進食量少，皮下脂肪萎縮，表現為頭皮靜脈顯露，突眼，無耳垂，薄唇。皮膚干皺，有色素斑及鈣鹽沉著斑，四肢皮膚表現硬皮病樣改變。禿頭，眉毛及睫毛稀疏，甲蒼白。乳牙遲出，換牙延遲，牙齒擁擠。囟門關閉延遲，鷹鉤鼻，小下頜，梨形胸，鎖骨短小或缺如，遠側趾指骨骨質溶解，髖外翻，骨質疏松。步態異常表現為曳行步態，騎馬步態，寬步。50%個體有胰島素抵抗，1～2歲時表現有以上大部分特征的個體都被認為是典型的HGPS［9-10］。本研究家系中先證者及其妹妹除表現出以上大部分特征外，先證者尚有斜頸表現，而其妹妹則患嚴重齲病，這點與Panigrahi等［2］報道的HGPS病例相同。綜合本研究家系中先證者除了有大部分典型的HGPS癥狀外，還有胸鎖乳突肌發育不良導致的斜頸，先證者妹妹患有嚴重的齲病。該家系患者癥狀符合典型HGPS臨床表現。大部分早老癥兒童均先有皮膚硬化后漸出現其他典型的早老表型，如本家系的先證者于2009年因皮膚硬化至我院皮膚科就診，當時患兒表現出明顯皮膚硬化，雙下肢活動障礙，且皮膚活檢亦符合硬皮病表現，但早老面容尚不明顯，從而被誤診為系統性硬皮病［8］。因早老癥為罕見疾病，故疾病早期較容易漏診、誤診。

本研究HGPS家系患者染色體核型G帶分析未見異常，表明疾病不是由于染色體畸變所致。Eriksson等最先在兩個早老癥小孩中發現LMNA基因上的雜合突變1824C＞T（G608G）［7，11］。隨后發現 R471C、R527C、G608S 和 c.2036C ＞ T等與HGPS有關［12］。研究表明，LMNA基因上的雜合突變位點G608G表現出常染色體顯性遺傳模式。然而在來自父母表型正常但為雜合突變攜帶者的同一個家庭，兄弟姐妹中出現多個HGPS患者（基因型為純合突變狀態），這種遺傳模式符合常染色體隱性遺傳方式。我們所研究的漢族HGPS家系遺傳模式則符合常染色體隱性遺傳方式。

LMNA基因上不同位置的突變可能導致不同的表型，即使同一位點突變引起的臨床表現也可能不同。本研究發現的HGPS家系患者是LMNA R527C純合突變所致。2009年Liang 等［13］最先在我國發現該突變位點，2013年 Xiong 等［10］報道了一個同樣為LMNA R527C純合突變的HGPS家系。本家系與前面報道的患者有一定的相似性，表型符合大部分典型HGPS的臨床表現，且符合Xiong報道的血磷升高，血清三酰甘油升高。本研究不同于前2例報道的臨床特征是：先證者無類似Liang等報道的腹瀉、便秘、脊柱嚴重畸形等情況。先證者及其妹妹囟門已閉合。先證者右側胸鎖乳突肌發育不良引起斜頸，同時血小板及D-二聚體升高，骨堿性磷酸酶升高，尿素肌酐升高。先證者的妹妹患有嚴重的齲病。這充分說明同一個突變位點會引起HGPS不同程度的表型。這是國際上繼Liang和Xiong等后發現的第3個R527C純合突變HGPS家系，也說明LMNA基因上的突變位點有一定的地域性，該突變位點好發于亞洲人。

LMNA基因位于1號染色體q21.1-21.3上，共有12個外顯子，編碼lamin A、lamin C參與組成核纖層。至少有12種不同的疾病是由于LMNA基因突變產生［14］。LMNA基因上的C.1579T純合突變導致了相應蛋白527位氨基酸的改變。R527及其相鄰的殘基R471、T528、M540和K542在空間構像上位于一個可引起早老癥樣疾病的突變熱點區［1］。該位點突變使得堿性精氨酸改變為中性半胱氨酸，這有可能破壞蛋白的表層結構，并對核纖層結構產生廣泛作用。

HGPS尚無有效的治療方法。有研究表明，法尼基化抑制劑可以逆轉表達早老蛋白細胞的核形態改變，同時小鼠體外實驗也暗示在早老癥治療領域中法尼基化抑制劑將會被有效使用。該類藥物有洛那法尼和替吡法尼，目前已進入臨床三期試驗［15］。但該類藥物只限于G608G突變導致細胞內有早老蛋白堆積的患者，其他罕見位點突變并無早老蛋白堆積［1］。本研究中發現的致病突變位點目前僅在中國報道，尚無報道稱該位點突變導致細胞內早老蛋白堆積，針對這個問題本課題組將在后期的研究中進一步驗證。

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2014-05-08）

（本文編輯：顏艷）

Analysis of clinical characteristics and causative genes of Hutchinson-Gilford progeria syndrome in a family

Qin Xia*，Luo Yanyan,Yuan Guangzhi,Chang Rongni,Lai Qingniao,Yang Yijin,Hua Rong,Li Fuji,Fang Ling,Wu Huayu,Ma Jun,Hu Qiping,Li Xiaolong,Yuan Zhigang,Lin Youkun,Shu Wei.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

s:Lin Youkun,Email:linyoukun7@aliyun.com;Shu Wei,Email:shuwei7866@126.com

ObjectiveTo assess clinicopathological features of and genetic factors in Hutchinson-Gilford progeria syndrome（HGPS）in a family.MethodsGeneral information was collected from 3 patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome in a family,which included 5 members over 2 generations with all the 3 children affected by HGPS.All the 3 patients underwent clinical investigation,image analysis of hands,lungs and mandibles,as well as karyotype analysis of chromosomes.LMNA gene mutations were analyzed in these family members.ResultsAll the 3 patients developed skin sclerosis with severe growth retardation and appearance of extreme aging at about 6 months of age.Image analysis showed osteoporosis and mandibular hypoplasia in the elder patient.Karyotype analysis showed no abnormality in the patients or their parents.Mutation analysis revealed a homozygous mutation 1579 C＞T （R527C）in exon 9 of the LMNA gene in all the patients,but a heterozygous mutation R527C in the LMNA gene in their parents.ConclusionsThe patients in this family present characteristic manifestations of HGPS,which may be caused by the homozygous LMNA mutation R527C.

Progeria;LMNA gene;DNA mutational analysis;Hutchinson-Gilford syndrome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.011

國家自然科學基金地區科學基金（81260479）；廣西自然科學青年基金（2013GXNSFBA019143）

530021南寧，廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚科（覃霞、羅彥彥、林有坤），脊柱外科（袁廣之）；廣西醫科大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學教研室（暢榮妮、賴青鳥、楊益金、華榮、李福記、方玲、吳華裕、馬軍、胡啟平、李曉龍、袁志剛、舒偉）

林有坤，Email：linyoukun7@aliyun.com；舒偉，Email：shuwei7866@126.com