白細胞介素22誘導HaCaT細胞表達肝素結合表皮生長因子樣生長因子的作用機制探討

劉欣欣 羅素菊 鄭焱 許文娟 李穎 劉全忠

白細胞介素22誘導HaCaT細胞表達肝素結合表皮生長因子樣生長因子的作用機制探討

劉欣欣 羅素菊 鄭焱 許文娟 李穎 劉全忠

目的 探討白細胞介素22（IL-22）誘導HaCaT細胞表達肝素結合表皮生長因子樣生長因子（HBEGF）的相關作用機制。方法 用不同濃度的IL-22（12.5、25、50、100μg/L）干預處理HaCaT細胞，對照組選擇等量磷酸鹽緩沖液（PBS）處理。24 h后，提取HaCaT細胞總蛋白進行蛋白免疫印跡，檢測絲裂原活化蛋白激酶-細胞外信號調節激酶1/2（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）的表達和轉錄激活因子途徑（JAK/STAT）中磷酸化 JAK2（P-JAK2）和磷酸化 STAT3（P-STAT3）的表達。將HaCaT細胞分 4組，分別用 PBS、IL-22、MAPK-ERK1/2抑制劑PD98059、JAK2/STAT3通路抑制劑AG490與IL-22共同干預HaCaT細胞，24 h后，提取細胞總蛋白和總mRNA，分別用蛋白免疫印跡法和實時定量逆轉錄（RT）-PCR法檢測不同處理組HB-EGF蛋白和mRNA水平的改變。采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析檢驗組間差異，Bonferroni檢驗進行多重比較。結果 不同濃度的IL-22干預處理后，HaCaT細胞中P-ERK1/2、P-JAK2和P-STAT3蛋白表達均高于對照組（P<0.05）。HB-EGF蛋白水平（HB-EGF/內參照的灰度比值）在PD98059組和AG490組分別為0.183±0.020和0.199±0.011，與 IL-22組（0.924±0.032）相比，差異具有統計學意義（F值分別為37.700、36.400，均P<0.05）。HB-EGF mRNA水平在PD98059組和AG490組分別為1.034±0.072和0.989±0.038，與IL-22組（1.844±0.135）相比，差異具有統計學意義（F值分別為11.271、13.429，均P<0.05）。結論 IL-22可以引起HaCaT細胞中MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路激活。IL-22誘導HaCaT細胞產生HB-EGF蛋白的作用機制可能與MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路有關。

白細胞介素-22；成纖維細胞生長因子1；角蛋白細胞；絲裂原激活蛋白激酶類；Janus激酶2；STAT3轉錄因子；銀屑病；HaCaT細胞

目前研究認為，銀屑病的發病機制主要是由T細胞介導的以表皮角質形成細胞為靶點的免疫應答反應。在其發病過程中Th17、Th22細胞及其細胞因子發揮重要作用。白細胞介素22（IL-22）為Th22細胞分泌的主要細胞因子，參與調節機體免疫反應。國內外研究表明，銀屑病患者外周血及皮損中IL-22水平較健康人高，且IL-22水平的高低與銀屑病嚴重程度密切相關［1-3］。肝素結合表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF）是表皮生長因子家族中的一員，可促進細胞的增殖，在銀屑病皮損中表達增高，并且其表達量與銀屑病病情相關［4］，提示其在銀屑病表皮異常增殖中發揮重要作用。以往研究表明，細胞外調節蛋白激酶（ERK）和信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）這兩種信號通路蛋白在角質形成細胞增殖信號傳導中至關重要［5］。我們的研究表明，IL-22可在基因和蛋白水平促進HaCaT細胞HBEGF的表達（未發表）。在本研究中，我們檢測IL-22對絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）和轉錄激活因子途徑（JAK/STAT）中磷酸化JAK2（P-JAK2）和磷酸化STAT3（P-STAT3）的影響，并通過抑制其信號傳導檢測其是否影響HaCaT細胞HB-EGF的表達，探討其可能的作用機制。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗細胞：HaCaT細胞系德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫學中心惠贈，為我實驗室長期凍存細胞。

2.主要試劑：重組人IL-22（美國Protein Specialists 公 司），P-ERK1/2、P-JAK2、JAK2、PSTAT3、STAT3、辣根過氧化物酶標記（HRP）-羊抗兔的二抗（美國CST公司），β肌動蛋白、HRP-羊抗鼠的二抗、HRP-兔抗山羊二抗（北京中杉金橋公司），ECL發光顯色液、熒光Mix（美國Invitrogen公司），PD98059、AG490（美國 Millipore公司），DMEM培養基（美國Gibico公司），Thermo逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司），HB-EGF抗體、HB-EGF蛋白ELISA試劑盒（美國RD公司）。HB-EGF及β肌動蛋白的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.主要儀器：酶聯免疫檢測儀（美國Biotek公司），凝膠成像系統儀（英國Cambridge公司），實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），CO2孵育箱（美國Forma Scientific公司）。

二、實驗方法

1.HaCaT細胞的復蘇與培養：將凍存的HaCaT細胞復蘇后，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液，于5%CO2、37℃條件下培養。待HaCaT細胞90%融合后，用0.25%胰酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化進行傳代培養。

2.HaCaT細胞的干預處理：將經傳代培養后處于對數生長期的細胞消化后，以1×105/ml接種于6孔板，37℃、5%CO2孵育培養。待細胞70%～80%融合時，進行饑餓處理2～3 h后，更換新的培養液，分別用 12.5、25、50、100μg/L 重組人 IL-22 進行干預，對照組用等量磷酸鹽緩沖液（PBS）干預。繼續于37℃、5%CO2孵育培養 24 h。

3.蛋白免疫印跡檢測信號通路相關蛋白：干預處理后的HaCaT細胞，用預冷PBS洗3遍，每孔加300μl細胞裂解液和2μl蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）。冰上裂解30min，用EP管收集細胞裂解液離心10min。測蛋白濃度后進行Western印跡。取上清，10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，每孔上樣量 25μl，電泳 90min，穩流 300 mA 轉膜 40min，轉膜后的硝酸纖維素膜分別用兔抗人一抗（PERK1/2、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3）4 ℃孵育過夜，后洗滌，用二抗（HRP標記的羊抗兔二抗）室溫孵育2 h，ECL暗室曝光顯色。檢測P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2的表達情況。每組實驗重復3次。

4.細胞信號通路阻斷劑阻斷實驗：

（1）細胞干預處理：對接種培養的HaCaT細胞分為4 組：①陰性對照組：PBS；②IL-22 組：50μg/L IL-22；③PD98059 組：50μmol/L PD98059+50μg/L IL-22；④AG490 組：50μmol/L AG490+50μg/L IL-22。抑制劑的選擇及使用濃度參照文獻［6-7］。

（2）蛋白免疫印跡檢測HB-EGF蛋白水平的改變：干預培養24 h后，按上述方法提取各組細胞的總蛋白進行蛋白免疫印跡，檢測HB-EGF蛋白水平的改變。實驗重復3次。

（3）實時熒光定量RT-PCR檢測HB-EGF基因水平的改變：干預處理24 h后吸去培養液，用PBS洗2遍，用Trizol試劑提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測吸光度（A260nm/A280nm），檢測RNA的純度及濃度。應用逆轉錄試劑盒合成cDNA。熒光定量PCR 反應體系：25μl，冰上加樣熒光定量 Mix12.5μl，上下游引物各 0.25μl，模板 cDNA 2μl，無 RNA 酶的雙蒸水10μl。按照試劑盒說明設定反應條件50℃2min促使尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）激活：然后95℃，2min預變性，1個循環；95℃15 s變性，60℃1min退火延伸，40個循環。進行熔解曲線分析判定PCR反應的特異性。HB-EGF上游引物：5′-GGCTCCCTCCTGCATCTG-3′，下游引物：5′-AGGAT GGTTGTGTGGTCATAGGT-3′。β肌動蛋白上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。合成的cDNA進行實時定量PCR擴增。每個樣本設3個復孔。上述RT-PCR實驗重復3次。

（4）ELISA法檢測HB-EGF蛋白的表達：采用雙抗體夾心ELISA法，參照試劑盒使用說明書進行。用酶標儀在450 nm波長處測量各孔的吸光度。每個樣本重復3次。制作樣品濃度標準曲線，并據其計算各樣品的濃度。應用二喹啉甲酸（BCA）法測樣品總蛋白濃度。統計不同樣品HB-EGF蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

三、統計結果處理

結 果

一、IL-22干預后HaCaT細胞中P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2蛋白的表達

免疫印跡結果顯示，12.5、25、50、100μg/L IL-22干預處理后，HaCaT細胞MAPK通路中P-ERK1/2表達量、JAK2/STAT3通路中P-STAT3表達量、PJAK2表達量均較對照組升高（表1），且與IL-22濃度有一定相關關系。3次重復實驗結果類似（圖1、2）。參照課題組前期研究及信號通路蛋白表達選擇50μg/L的IL-22進行信號通路阻斷實驗。

表1 IL-22干預后HaCaT細胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表達量（與β肌動蛋白灰度比值，±s）

表1 IL-22干預后HaCaT細胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表達量（與β肌動蛋白灰度比值，±s）

注：n=3

組別 P-ERK1/2 P-STAT3 P-JAK2 IL-22干預組12.5μg/L 0.588±0.043 0.755±0.091 0.358±0.069 25μg/L 0.625±0.032 0.823±0.060 0.454±0.053 50μg/L 0.857±0.068 0.906±0.097 0.531±0.093 100μg/L 0.975±0.057 0.984±0.119 0.843±0.078對照組 0.324±0.108 0.460±0.106 0.130±0.017 F值 42.55 13.01 44.95 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 白細胞介素22（IL-22）對HaCaT細胞MAPK通路蛋白ERK及P-ERK表達的影響 1：對照組；2～5：分別為12.5、25、50、100μg/L IL-22 組

圖2 白細胞介素22（IL-22）對HaCaT細胞JAK2/STAT3通路蛋白表達的影響 1：對照組；2～5：分別為12.5、25、50、100μg/L IL-22組

圖3 部分信號通路阻斷HaCaT細胞中肝素結合表皮生長因子樣生長因子的表達 1：對照組；2：50μg/L IL-22；3：50μg/L IL-22+PD98059；4：50μg/L IL-22+AG490

二、通路阻斷實驗結果

1.加入信號通路阻斷劑后HB-EGF蛋白水平的改變：蛋白免疫印跡結果顯示，在加入信號通路阻斷劑后，HB-EGF蛋白表達量（HB-EGF/β肌動蛋白灰度比值）PD98059組為0.183±0.020，較IL-22組（0.924±0.032） 降低（F=37.700，P＜0.05）；AG490組（0.199±0.011）也較IL-22組降低（F=36.400，P＜0.05）。結果見圖3。

2.加入信號通路阻斷劑后HB-EGF mRNA水平的變化：加入信號通路阻斷劑后HB-EGF mRNA表達水平均較IL-22組減少。PD98059組HB-EGF mRNA表達水平（2-ΔΔCt）為1.034±0.072，較IL-22組（1.844±0.135）降低（F=11.271，P<0.05）；同時AG490組（0.989±0.038）較IL-22組亦降低（F=13.429，P<0.05）。

三、不同干預處理組HB-EGF蛋白的濃度與總蛋白濃度的比值

在加入信號通路抑制劑后，HB-EGF蛋白表達均較IL-22組降低。HB-EGF與總蛋白濃度比值在對照組為（0.816±0.152）× 10-3，PD98059 組為（0.852±0.159）×10-3，AG490組為（1.049±0.166）×10-3，后兩組與 IL-22組（2.067±0.160）× 10-3比較均降低，F值分別為20.933、5.414，均P<0.05。

討 論

本實驗研究結果顯示，IL-22可誘導HaCaT細胞MAPK信號通路中P-ERK1/2蛋白表達增加，加入MAPK-ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059后，HB-EGF蛋白和mRNA的表達較未加抑制劑組明顯降低。提示MAPK-ERK1/2信號通路在IL-22促進HB-EGF的表達中發揮重要作用。同樣濃度IL-22干預后，JAK2/STAT3信號通路中P-JAK2和P-STAT3蛋白水平均明顯升高。加入JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后，HB-EGF無論從蛋白水平還是基因水平均較無抑制組降低。

有研究顯示，IL-22可通過促進HaCaT細胞PERK1/2和P-STAT3升高進而引起角蛋白17升高［8］。HB-EGF可促進角質形成細胞的增殖和遷移。研究表明，HB-EGF在正常皮膚表皮中不表達或表達量很低，而在銀屑病患者皮損中表達升高，其表達水平與銀屑病的嚴重程度有一定的相關性，提示其在銀屑病表皮異常增殖中發揮重要作用［9］。IL-22受體廣泛分布于免疫細胞中，參與調控角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞等其他組織細胞的增殖和分化，尤其在角質形成細胞的增殖、分化及免疫中起重要作用［10］。在銀屑病皮損中IL-22受體較正常皮膚增多，提示IL-22受體參與銀屑病的表皮異常增殖［11］。因此我們推測IL-22通過與HaCaT細胞表面IL-22受體結合引起細胞內通路激活。

銀屑病皮損的棘層和基底層角質形成細胞中存在ERK1/2的磷酸化，并且與角質形成細胞的過度增殖相關［12-13］。另外，ERK1/2的磷酸化可促進T細胞活化、增殖和抗凋亡作用［14］。研究表明，在銀屑病患者的皮損中STAT3表達明顯升高［15-16］。在銀屑病患者機體內STAT3參與Th17細胞信號傳導過程，與角質形成細胞過度增殖和炎性浸潤有關［17］。

綜上所述，IL-22可使HaCaT細胞HB-EGF、PERK1/2蛋白、P-JAK2和P-STAT3蛋白水平升高。MAPK-ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059和JAK2/STAT3通路抑制劑AG490可明顯抑制HBEGF的表達，提示IL-22可能通過MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條通路誘導HB-EGF的表達。提示阻斷IL-22信號通路傳導可減少HB-EGF的表達，進一步研究可能為治療銀屑病提供一個新的治療途徑。

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2014-04-24）

（本文編輯：尚淑賢）

Mechanisms underlying interleukin-22-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor in HaCaT cells

Liu Xinxin*,Luo Suju,Zheng Yan,Xu Wenjuan,Li Ying,Liu Quanzhong.*Department of Dermatology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

Luo Suju,Email:luosuju2005@163.com

ObjectiveTo investigate the mechanisms underlying interleukin-22（IL-22）-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor（HB-EGF）in HaCaT cells.MethodsSome HaCaT cells were divided into several inverention groups treated with IL-22 at concentrations of 12.5,25,50,100μg/L,respectively and a control group treated with phosphate buffer saline （PBS）.After 24-hour culture,total proteins were extracted from the HaCaT cells,and Western blot was performed to measure the expression of phosphorylated extracellular signalregulated kinase 1/2 （P-ERK1/2）in the mitogen-activated protein kinase （MAPK）-ERK1/2 pathway,as well as phosphorylated-JAK2（P-JAK2）and phosphorylated-signal transducer and activator of transcription 3 （P-STAT3）in the JAK2/STAT3 pathway.In a blocking experiment,some HaCaT cells were divided into 4 groups to be treated with PBS,IL-22,PD98059 （an inhibitor of MAPK-ERK1/2）combined with IL-22 （PD98059 group）,AG490 （an inhibitor of JAK2/STAT3）combined with IL-22 （AG490 group）,respectively.After 24-hour treatment,total proteins and mRNAs were extracted from the HaCaT cells followed by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR for the measurement of protein and mRNA expressions of HB-EGF respectively.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 16.0 by one-way analysis of variance （ANOVA）for intergroup comparisons and by Bonferroni′s test for multiple comparisons.ResultsAfter treatment with IL-22 at the above 4 concentrations,the expressions of P-ERK1/2,P-JAK2 and P-STAT3 in HaCaT cells were all increased compared with the control group（allP<0.05）.The protein and mRNA expression levels（expressed as the HB-EGF/β-actin ratio and 2-△△Ctrespectively）of HB-EGF were both significantly decreased in the PD98059 group and AG490 group than in the IL-22 group（protein:0.183±0.020 and 0.199±0.011 vs.0.924±0.032,F=37.700,36.400,respectively,bothP＜0.05;mRNA:1.034±0.072 and 0.989±0.038 vs.1.844±0.135,F=11.271,13.429,respectively,bothP＜0.05）.ConclusionsIL-22 can activate the MAPK-ERK1/2 and JAK2/STAT3 signaling pathways in HaCaT cells,which may contribute to IL-22-induced expression of HB-EGF in HaCaT cells.

Interleukin-22;Fibroblast growth factor 1;Keratinocytes;Mitogen-activated protein kinases;Janus kinase 2;STAT3 transcription factor;Psoriasis;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.009

國家自然科學基金（81201231、81371732）

300052天津醫科大學總醫院皮膚科（劉欣欣、羅素菊、許文娟、劉全忠），肺癌研究所（李穎）；西安交通大學第二醫院皮膚科（鄭焱）

羅素菊，Email：luosuju2005@163.com