牦牛腸黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的比較觀察

楊學(xué)軍方梅左愈臻李棟趙興緒賈寧*

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 730070；2，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 730046）

牦牛腸黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的比較觀察

楊學(xué)軍1,2方梅1左愈臻1李棟1趙興緒1賈寧1*

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 730070；2，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 730046）

為了揭示牦牛腸道黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的分布特點(diǎn)與規(guī)律，本研究采用組織學(xué)及透射電鏡等技術(shù)，對(duì)牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的分布進(jìn)行了比較研究。結(jié)果顯示，牦牛腸黏膜有多量漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞分布，且分布不均勻。漿細(xì)胞在整個(gè)腸道以盲腸黏膜最豐富；肥大細(xì)胞在十二指腸黏膜分布最多；杯狀細(xì)胞在直腸黏膜分布最多。超微結(jié)構(gòu)顯示，漿細(xì)胞呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)沿核膜排列，胞漿中有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；杯狀細(xì)胞呈高腳杯狀，細(xì)胞頂端含有大量的分泌顆粒而膨大；肥大細(xì)胞呈橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)高電子密度的大小不等的膜包顆粒。研究證明，牦牛腸道各段有規(guī)律的分布了豐富的漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞，顯示牦牛腸道黏膜具有很強(qiáng)的黏膜免疫屏障功能。

牦牛；腸道黏膜；上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞；電鏡；分布特點(diǎn)；比較研究

牦牛（yak）是青藏高原特有的珍稀畜種，其對(duì)高寒、缺氧、低壓、強(qiáng)紫外線(xiàn)照射等多種環(huán)境刺激具有極強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。因此，牦牛消化道黏膜免疫特性應(yīng)具有獨(dú)特的適應(yīng)基礎(chǔ)。家畜腸道不僅具有對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的功能，同時(shí)也具有免疫屏障功能[2]。已有學(xué)者對(duì)相關(guān)動(dòng)物腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分布和數(shù)量進(jìn)行了研究[3，4]。到目前為止，有關(guān)牦牛腸道黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的分布特點(diǎn)和比較變化規(guī)律，尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究對(duì)牦牛腸道黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的分布進(jìn)行了比較觀察，探討牦牛腸道黏膜的屏障特性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及樣品處理

16例牦牛（10♂6♀）均來(lái)自青海某屠宰場(chǎng)。經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死后，迅速切取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、盲腸和直腸數(shù)段。每例牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸與直腸每隔10cm取一塊（約5cm），分別取4塊。牦牛結(jié)腸較長(zhǎng)，每例結(jié)腸每隔80cm取一塊（約5cm），共取8塊。樣品置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定。同時(shí)，在牦牛放血處死后30min內(nèi)切取腸道各段黏膜（1mm3）數(shù)塊電鏡樣品，于2%多聚甲醛–2.5%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱保存。

1.2 石蠟切片與染色

固定后的樣品，常規(guī)石蠟包埋，制備連續(xù)切片。HE染色、Masson三色染色、PAS（高碘酸–Schiff氏）染色、MGP（甲基綠派洛寧，Methyl green-Pyronin）染色及MTB（甲苯胺藍(lán)）染色，光鏡觀察。

1.3 透射電鏡觀察

對(duì)所取電鏡材料采用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液預(yù)固定后，再經(jīng)1%鋨酸PBS溶液后固定，丙酮乙醇梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾與硝酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.4 測(cè)量與數(shù)據(jù)處理

采用光鏡對(duì)牦牛腸道各段連續(xù)切片進(jìn)行觀察、拍照，以及測(cè)量、統(tǒng)計(jì)（采用Image-Pro Plus軟件）。每段腸道做連續(xù)切片，每隔十張取一張，共取5張。選取腸道各段黏膜上皮細(xì)胞排列整齊連續(xù)的切片，統(tǒng)計(jì)每150個(gè)上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞數(shù)量。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和比較（采用SPSS 17.0軟件）。

2 結(jié)果

研究結(jié)果表明，牦牛腸道漿細(xì)胞主要分布于腸黏膜固有層的腸腺之間，胞核位于細(xì)胞中央或一端。在整個(gè)腸道中漿細(xì)胞數(shù)量在盲腸分布最豐富（圖1）。小腸從十二指腸、空腸到回腸漿細(xì)胞逐漸增多且差異顯著（P＜0.05），盲腸達(dá)到最多，從盲腸、結(jié)腸至直腸依次減小（表1）。杯狀細(xì)胞散在于腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺柱狀細(xì)胞之間，細(xì)胞頂部因含有糖原顆粒而膨大，底部纖細(xì)，呈典型的高腳杯狀（圖1）。杯狀細(xì)胞在直腸數(shù)量最多（表1）（圖2），在盲腸最少，兩者差異顯著（P＜0.05），結(jié)腸與直腸之間差異不顯著，結(jié)腸與盲腸之間差異顯著（P＜0.05）（表1）。直腸因杯狀細(xì)胞分泌大量黏液，使黏膜表面覆有厚層黏性薄膜。在小腸杯狀細(xì)胞由十二指腸到回腸也是逐漸減少且差異顯著（P＜0.05）（表1）。肥大細(xì)胞大多分布于腸黏膜固有層腸腺及小血管和小淋巴管周?chē)つは聦印⒓雍蜐{膜有少量分布。肥大細(xì)胞數(shù)量在十二指腸黏膜分布最多（圖3），由十二指腸到回腸逐漸減少且差異顯著（P＜0.05）（表1）。大腸肥大細(xì)胞與小腸比較相對(duì)較少，且結(jié)腸和盲腸差異不顯著，直腸分布最少（表1）。

圖1 牦牛盲腸黏膜豐富的漿細(xì)胞，HE染色×400

圖2 牦牛直腸黏膜豐富的杯狀細(xì)胞，PAS染色×400

圖3 牦牛十二指腸黏膜豐富的肥大細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色×400

表1 牦牛腸道黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞分布變化（n=150）

電鏡下，漿細(xì)胞呈橢圓形，核膜清晰，胞質(zhì)中除少量線(xiàn)粒體外，幾乎充滿(mǎn)粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖4）。杯狀細(xì)胞頂端呈不規(guī)則游離面，散在于柱狀細(xì)胞之間，細(xì)胞間界限輪廓清晰，頂部側(cè)面與相鄰細(xì)胞以中間連接和橋粒相連，胞質(zhì)中充滿(mǎn)著黏液顆粒，有些顆粒相互融合，成為較大的分泌泡。肥大細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞核較大，核膜清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)內(nèi)有高電子密度的大小不等的圓形顆粒聚集（圖5）。

圖4 牦牛腸道黏膜漿細(xì)胞，×12000

圖5 牦牛腸道黏膜肥大細(xì)胞，×12000

3 討論

腸道不僅是消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所，而且具有重要的免疫屏障功能[5]。黏膜的防御功能與黏膜的各種免疫相關(guān)細(xì)胞的數(shù)量和分布密切相關(guān)。漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞在腸黏膜免疫屏障中扮演著重要的角色。腸黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞作為腸道相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)特殊組分，是機(jī)體免疫系統(tǒng)中與外來(lái)抗原以及微生物發(fā)生接觸的重要免疫細(xì)胞，同時(shí)也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要細(xì)胞[6，7]，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列黏膜免疫應(yīng)答。因此，腸道黏膜漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的數(shù)量可以反映腸道局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度。本研究表明，牦牛腸道漿細(xì)胞主要分布于腸黏膜固有層的腸腺之間，胞核位于細(xì)胞中央或一端。在整個(gè)腸道中漿細(xì)胞數(shù)量在盲腸分布最豐富。而漿細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞發(fā)育的最終階段，主要參與體液免疫[8，9]。大量IgA可通過(guò)分泌片段的介導(dǎo)進(jìn)入腸黏膜表面，中和抗原物質(zhì)（如細(xì)菌、毒素等），起到清除外來(lái)抗原和保護(hù)機(jī)體的作用[10]。

本研究也表明，牦牛腸道杯狀細(xì)胞散在于腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺柱狀細(xì)胞之間，細(xì)胞頂部因含有糖原顆粒而膨大，底部纖細(xì)，呈典型的高腳杯狀。杯狀細(xì)胞在直腸數(shù)量最多。直腸因杯狀細(xì)胞分泌大量黏液，使黏膜表面覆有厚層黏性薄膜。而分泌黏蛋白是杯狀細(xì)胞的主要功能之一。黏蛋白可對(duì)機(jī)體腸黏膜起到機(jī)械性保護(hù)作用，是腸道機(jī)械屏障的組成之一[9-11]。

牦牛腸道肥大細(xì)胞大多分布于腸黏膜固有層腸腺及小血管和小淋巴管周?chē)つは聦印⒓雍蜐{膜有少量分布。肥大細(xì)胞數(shù)量在十二指腸黏膜分布最多。而肥大細(xì)胞源于骨髓造血干細(xì)胞，其增殖分化成熟中隨血流遷移至結(jié)締組織。一方面，在動(dòng)物機(jī)體天然免疫中肥大細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用；另一方面，肥大細(xì)胞還能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，通過(guò)這些生物活性物質(zhì)參與機(jī)體獲得性免疫[11，12]。

總之，牦牛腸道黏膜具有豐富的漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，其分布并不均勻，它們?cè)陉笈?duì)環(huán)境適應(yīng)及黏膜免疫屏障保護(hù)中具有十分重要的作用。

[1]郭文場(chǎng),劉志宏,楊柏明,等.高原之舟—中國(guó)牦牛[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,1998(5):4-5.

[2]Gaskins H R.The intestinal immune system:gut reaction and growth of the pig[J].A nim Sci,1996,74(Suppl1):169.

[3]Turck D,Feste A S,Lifschitz C H.Age and diet affect the composition of porcine colonic mucins[J].Pediatric Research,1993,33(66):564-567.

[4]左愈臻,高世杰,邵建華,等.成年牦牛小腸結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量變化研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(12):1776-1781.

[5]魯延剛,高世杰,方梅,等.牦牛皺胃組織結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(3):469-475.

[6]宋恩亮,陳耀星,王子旭,等.利雜犢牛小腸各段長(zhǎng)度與黏膜結(jié)構(gòu)的發(fā)育學(xué)變化[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):66-70.

[7]宋恩亮,陳耀星,王子旭,等.肉犢牛小腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的數(shù)量變化研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,38(10):1109-1114.

[8]Bauer E,Williams B A,Smidt H.Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals.Curr Issues Intest Microbiol,2006,7(2):35-51.

[9]Bauer E,Williams B A,Smidt H.Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals.Curr Issues Intest Microbiol,2006,7(2):35-51.

[10]Owens D,Mcgee M,Boland T.Effect of grass regrowth interval on intake,rumen digestion and nutrient flow to the omasum in beef cattle[J].Animal Feed Science and Technology Vol ume,2008,9(15):21-41.

[11]Metz M,Siebenhaar F,Maurer M.Mast cell functions in the innate skin immune system[J].Immunobiology,2008,213(3):251-260.

[12]姜楠,胡易,陳耀星,等.肥大細(xì)胞在動(dòng)物腸道黏膜免疫屏障中的作用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2011,38(4):167-170.

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：1308RJZA220。

楊學(xué)軍（1968-），男，碩士，副研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

?通訊作者：賈寧，教授，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。