新型稀釋液TCM199和EG凍存牛精液效果試驗(yàn)

桑國(guó)俊 郭海龍 容維中 王珂 邱忠玉（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所 744000）

新型稀釋液TCM199和EG凍存牛精液效果試驗(yàn)

桑國(guó)俊 郭海龍 容維中 王珂 邱忠玉（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所 744000）

通過對(duì)以TCM199為主要稀釋劑，以EG為冷凍保護(hù)劑的牛細(xì)管凍精的活力測(cè)定，篩選出了以TCM199、EG為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑的新型牛細(xì)管凍精制作配方。測(cè)定表明，以TCM199為主要稀釋劑、EG為冷凍保護(hù)劑時(shí)，配方11的活力最高，達(dá)到0.55。

TCM199；EG；GL；細(xì)管凍精；活力

1 試驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/h2>

近年來的研究表明，在細(xì)胞、胚胎冷凍過程中，為了克服低溫對(duì)胚胎等微小生命的打擊，減少或消除細(xì)胞和組織間冰晶的形成，必須在培養(yǎng)液中添加一定量的抗凍劑。以前使用的主要是二甲基亞砜（DMSO）或甘油（GL），但是他們均對(duì)細(xì)胞或胚胎產(chǎn)生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL強(qiáng)，所以現(xiàn)多用GL。乙二醇（EG）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型抗凍劑，用EG冷凍時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的冰晶更少；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，EG對(duì)細(xì)胞的毒副作用較小。本試驗(yàn)將利用TCM199作為能量和營(yíng)養(yǎng)素來源，以EG作為冷凍保護(hù)劑，多梯度研究TCM199、EG作為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑保護(hù)精子的最優(yōu)劑量，建立新型牛精液稀釋和冷凍保存技術(shù)。

2 試驗(yàn)設(shè)備和要求

種公牛來自寧縣興旺牧業(yè)種牛場(chǎng)和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所牛場(chǎng)。主要設(shè)備有人工采精器械、專用保溫箱、吸管、冰箱、冷凍儀等。

3 試驗(yàn)方法和步驟

稀釋液：按照設(shè)計(jì)配方、用量進(jìn)行配制。冷凍液：第一液為低濃度冷凍液，用于牛精液采集后的第一次稀釋；第二液為高濃度冷凍液，用于第二次平衡稀釋。TCM199按照其說明濃度配制，并用酚紅和NaOH進(jìn)行pH標(biāo)定。EG按照設(shè)計(jì)添加。

本試驗(yàn)針對(duì)以下3種處理實(shí)施，即測(cè)定不含冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果、添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑的精子凍存效果、以TCM199和EG為冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果。每個(gè)水平測(cè)定10次（重復(fù)），每次制作100枚細(xì)管凍精，從中隨即抽檢10枚，每次抽檢測(cè)定均在制凍后24h進(jìn)行。用Spss統(tǒng)計(jì)分析。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 不含冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

4.1.1 配方組合

系列配方中設(shè)計(jì)缺失TCM199、EG，僅僅用常規(guī)能量、抗生素構(gòu)成稀釋液，并進(jìn)行冷凍保存和解凍測(cè)定，評(píng)定和掌握牛精液的保存和抗冷凍打擊的特性。各組合配方詳見表1。

配方中用卵磷脂替代卵黃，添加Tris以圖進(jìn)一步提高稀釋液的緩沖能力，給精子提供良好的生存環(huán)境。

4.1.2 不含冷凍保護(hù)劑的細(xì)管凍精解凍效果

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)定的時(shí)間，對(duì)凍存24h后的試驗(yàn)凍精進(jìn)行解凍。解凍時(shí)先準(zhǔn)備好30℃水浴，將細(xì)管凍精在水浴中攪動(dòng)2～3s解凍，用細(xì)管剪剪掉細(xì)管兩端封口，分別在安排時(shí)段提取該管解凍精液抹片觀察和記錄，觀察溫度為25℃。

每組配方測(cè)定10枚細(xì)管凍精。解凍效果統(tǒng)計(jì)詳見表2。

測(cè)定結(jié)果表明：

（1）在不添加冷凍保護(hù)劑和稀釋劑，但添加果糖等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)素的情況下，用超純水稀釋冷凍的牛精液也保持了適度的解凍活力。效果最好的為8號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.3的水平。

（2）在不添加其它成分，僅僅用超純水稀釋的情況下，解凍凍精也有較高的活力，并且維持了較長(zhǎng)時(shí)間。如10號(hào)配方，剛解凍后的活力有0.45，只是有效活力維持時(shí)間短。

（3）活力衰減速率不一致。各組在0～6h期間的活力下降最快，6～30h期間活力緩慢下降，30～48h期間的活力平穩(wěn)下降。

表1 不含冷凍保護(hù)劑的配方組合

表2 不含冷凍保護(hù)劑的時(shí)凍存凍精的解凍效果

4.2 添加TCM1.9但不含冷凍保護(hù)劑的細(xì)管凍精解凍效果

本項(xiàng)試驗(yàn)中，稀釋液僅僅添加了不同劑量的TCM199，未添加EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷凍保存過程中的效果。各組配方和效果測(cè)定分述如下。

4.2.1 配方組合

添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組的配方詳見表3。在測(cè)定不同濃度TCM199的同時(shí)，在平行配方中還添加了Tris、檸檬酸鈉、卵磷脂等。其中1、2、3、4、7號(hào)添加了Tris，5、6、8號(hào)添加了檸檬酸鈉，9號(hào)添加了卵磷脂。

4.2.2 細(xì)管凍精解凍效果

添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組的解凍效果詳見表4。

測(cè)定結(jié)果表明：

（1）在只添加TCM199而未添加冷凍保護(hù)劑的情況下，冷凍解凍精液也保持了一定的活力。效果最好的為1號(hào)和5號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。其它各組合在剛解凍時(shí)活力還較高，但持續(xù)時(shí)間短，活力下降速度快。

（2）活力下降高峰期出現(xiàn)在0～6h階段。各組下降速度基本一致，在圖2中顯示出相似的斜率。在6～24h階段，各組合活力的下降速度趨緩，但在24～30h階段又出現(xiàn)了活力迅速下降的現(xiàn)象，此后精子開始顯著衰竭、殘缺和死亡，失去了受精能力。

4.3 以TCM1.9和EG為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

4.3.1 配方組合

本組試驗(yàn)了以TCM199稀釋劑和以EG為冷凍保護(hù)進(jìn)行的牛精液冷凍效果試驗(yàn)。目的是探討TCM199和EG相互作用于精液的效果，其配方詳見表5。本項(xiàng)試驗(yàn)中，在測(cè)定不同濃度TCM199、EG的同時(shí)，在平行配方中還添加了卵磷脂、Tris、檸檬酸鈉及果糖。

表3 添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組的配方

表4 添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組活力測(cè)定統(tǒng)計(jì)

表5 TCM199+EG的配方組合

4.3.2 細(xì)管凍精解凍效果

細(xì)管凍精的凍存和解凍及測(cè)定方法同GL組。解凍效果詳見表6。

表6 TCM199+EG的配方組合活力測(cè)定統(tǒng)計(jì)

測(cè)定結(jié)果表明：

（1）不同濃度TCM199+EG組的凍精解凍活力不同。0～12h階段的活力以2、9、11號(hào)組高于其它組（p＜0.01），同時(shí)，1、4號(hào)活力最低。

（2）活力衰減速率不一致。活力衰減分為比較明顯的3個(gè)階段，其中0～6h為第一階段，其特點(diǎn)是活力下降速度快；6～24h為第二階段，各組的活力均緩慢下降；24～48h為第三階段，活力進(jìn)一步下降到消失。在這3個(gè)起伏階段中，與TCM199+GL試驗(yàn)相似，依然是單純由TCM199+GL的組如11號(hào)的活力好于其它組，其次是未添加檸檬酸鈉的組，活力比較低的是既添加檸檬酸鈉又添加果糖的試驗(yàn)組。但與TCM199+GL試驗(yàn)相比，TCM199+EG的各組試驗(yàn)的活力相對(duì)較低。2號(hào)配方中添加了卵磷脂，活力也較高。

5 結(jié)果與分析

通過本次對(duì)TCM199、EG組及其對(duì)比試驗(yàn)表明，在不添加TCM199、EG、的情況下，雖然牛精液冷凍解凍后保持了一定的活力，但活力維持時(shí)間很短，鏡像觀察中存在大量畸形精子，表現(xiàn)為斷尾、粘連、頂體缺失、側(cè)行和逆行，不具備應(yīng)用價(jià)值。其它三組試驗(yàn)中，總體活力以TCM199+EG系列最好，純TCM199系列次之。

（1）未添加試驗(yàn)成分的牛精液的冷凍解凍效果。本試驗(yàn)的基礎(chǔ)液為果糖和超純水，部分組合中添加了檸檬酸鈉、Tris或卵磷脂，但未添加EG抗凍劑。其冷凍精液解凍后也表現(xiàn)出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，畸形精子迅速增多，可判斷為該類精子的受精能力低下，不能用于生產(chǎn)性配種繁育。同時(shí)也說明牛精液自身具備良好的抗低溫打擊能力。

（2）以TCM199為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗(yàn)是在基礎(chǔ)液果糖和超純水的基礎(chǔ)上，加入了TCM199，同時(shí)也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、Tris或卵磷脂，但未添加EG。其冷凍精液解凍后的表現(xiàn)與未添加TCM199和EG組相似，也表現(xiàn)出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，畸形精子不斷增多。效果最好的為1號(hào)和5號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。

（3）以TCM199+EG為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗(yàn)是在基礎(chǔ)液果糖和超純水的基礎(chǔ)上，加入了TCM199和EG，同時(shí)也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、Tris或卵磷脂。其冷凍精液解凍活力明顯高于未添加TCM199和EG組和僅添加TCM199的組。測(cè)定表明，該組2、9、11號(hào)的活力最好。

（4）綜合分析。通過對(duì)3種不同處理及其多樣本資源的測(cè)定與分析，表明牛精液的處理方法不同，其凍精解凍活力不同。空白處理和僅添加TCM199的處理測(cè)定說明了精子本身具有良好的抗低溫打擊能力，解凍活力較好，但維持時(shí)間很短，活力喪失速度快，精子品種不佳，不具備受精能力。TCM199+EG組的解凍凍精的質(zhì)量較高，其解凍精子的活力維持時(shí)間較長(zhǎng)，精子品質(zhì)較高。推薦配方為TCM199+EG組的配方11。

（5）小結(jié)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，TCM199、EG對(duì)牛精子均有良好的冷凍保護(hù)能力；其它營(yíng)養(yǎng)成分的變化對(duì)EG和GL保護(hù)精子的效果有一定影響，特別是卵黃的作用在營(yíng)養(yǎng)組份中的作用比較明顯。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目“EG和TCM199提高牛精液冷凍效果的關(guān)鍵技術(shù)研究”。

桑國(guó)俊（1963-），男，甘肅省臨洮縣人，研究員，博士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。