湖南省辣椒上首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲

王 劍, 宋志強(qiáng), 成飛雪, 程菊娥, 張德詠*, 劉 勇*

(1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410125; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410125)

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湖南省辣椒上首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲

王 劍1, 宋志強(qiáng)2, 成飛雪2, 程菊娥2, 張德詠2*, 劉 勇2*

(1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410125; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410125)

應(yīng)用線蟲比較形態(tài)學(xué)、同工酶技術(shù)和IGS-PCR技術(shù),對(duì)采自湖南省永州地區(qū)辣椒上的根結(jié)線蟲進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果表明,該病原線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii),這是首次在湖南地區(qū)發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲。

象耳豆根結(jié)線蟲; 辣椒; 鑒定; 湖南省

象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii)是一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有潛在危害性的植物病原線蟲。其寄主范圍廣,且在番茄上能突破Mi基因抗性[1-2]。該線蟲1983年在我國(guó)海南省儋州市象耳豆樹上被發(fā)現(xiàn)[3]。近年來(lái),在海南、廣州等地發(fā)現(xiàn)該線蟲寄生于豆科、茄科、葫蘆科的多種重要經(jīng)濟(jì)作物以及番石榴等水果,且造成較大危害[1,4]，但在湖南未見(jiàn)其發(fā)生分布的報(bào)道。2012-2013年,我們?cè)诤嫌乐莸貐^(qū)進(jìn)行蔬菜根結(jié)線蟲病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),一種根結(jié)線蟲病原嚴(yán)重危害該地區(qū)辣椒生產(chǎn),造成辣椒萎蔫,早衰,產(chǎn)量損失極大。我們從形態(tài)、同工酶以及分子生物學(xué)上對(duì)該病原線蟲進(jìn)行了種類鑒定,以期為準(zhǔn)確鑒定與控制該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

從湖南省永州市零陵區(qū)接履橋鎮(zhèn)接履橋村大象組一農(nóng)戶辣椒地采集感病辣椒,挑取卵囊室內(nèi)接種于辣椒上擴(kuò)繁保存、備用。

1.2 病原線蟲形態(tài)觀察

觀察雌蟲、雄蟲及2齡幼蟲(J2)的形態(tài)特征,并測(cè)量特征值,共測(cè)量20 條。拔取感病辣椒,清水洗根,在倒置顯微鏡下用鑷子和解剖針?lè)蛛x成熟雌蟲于清水中,參照馮志新等[5-6]方法制作會(huì)陰花紋臨時(shí)裝片,利用Olympus顯微鏡(BX51型)觀察雌蟲會(huì)陰花紋并拍照。

挑取根中卵囊,室內(nèi)孵化,分離、收集2齡幼蟲,并采用熱殺死、TAF固定液固定,制備臨時(shí)裝片,在顯微鏡下觀察、測(cè)量體長(zhǎng)、體寬、口針長(zhǎng)、DGO和尾長(zhǎng)等參數(shù)[7]。

1.3 同工酶分析

病原線蟲的酯酶(Est)和蘋果酸脫氫酶(MDH)分析參照Esbenshade等的方法[8],電泳分析采用DYCZ-24D型垂直板電泳槽,凝膠板大小為83 mm × 75 mm,聚丙烯酰胺膠厚度0.75 mm,分離膠與濃縮膠濃度分別為12%和5%。采用DYY-6C型電泳儀電泳,80 V 1 h，然后200 V 3 h。電泳緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。每孔道加入2個(gè)年輕雌蟲的酶浸提液,以已鑒定的南方根結(jié)線蟲(M.incognita)樣本作為對(duì)照。Est和MDH染色過(guò)程參照Esbenshade等[9]的方法。將同一膠條先后放入Est和MDH染色液中分別顯色20～30 min,直至出現(xiàn)清晰條帶,待顯色完全后漂洗3次,放入10%醋酸中固定,拍照。并參照Esbenshade等[8]的標(biāo)準(zhǔn)判斷Est和MDH譜型,初步確定根結(jié)線蟲種類。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 ITS序列分析

利用ITS-PCR技術(shù)對(duì)采集自辣椒上的病原線蟲進(jìn)行分子鑒定。ITS區(qū)序列擴(kuò)增通用引物[10]為F:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′,R:5′-ATCCACCGATAAGGGTAGAA-3′。采用單條線蟲擴(kuò)增。將消毒清洗后單條J2線蟲放入含有5 μL TE buffer(pH 8.0)的0.2 mL PCR管中,加入蛋白酶K,使其終含量為0.5 mg/mL。混勻后65 ℃消化1 h,95 ℃滅活10 min,10 000 r/min 離心1 min,取上清液10 μL作為PCR反應(yīng)模板。25 μL PCR反應(yīng)體系中其他試劑參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[11]。擴(kuò)增條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。割膠回收PCR產(chǎn)物并送華大基因測(cè)序,測(cè)得的序列在GenBank中進(jìn)行在線BLAST。

1.4.2 IGS2序列分析

根據(jù)ITS序列比對(duì)結(jié)果,參照Long[12]等的方法設(shè)計(jì)象耳豆根結(jié)線蟲IGS2序列特異引物:Me-F(5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′),Me-R(5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′),進(jìn)行IGS2 PCR擴(kuò)增與序列比對(duì)。擴(kuò)增方法同上。利用DNAMAN將所得序列與已報(bào)道的象耳豆根結(jié)線蟲序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原線蟲形態(tài)鑒定

湖南永州辣椒上的根結(jié)線蟲雌蟲蟲體呈梨形或橢圓形;頸明顯突出,頭區(qū)無(wú)環(huán)紋,唇盤圓盤狀,略突起;口針細(xì)長(zhǎng),基部球粗大,椎體部與桿部等長(zhǎng);排泄孔位于近中食道球處;種群內(nèi)雌蟲會(huì)陰花紋有差異,呈卵圓形或橢圓形,線紋平滑,背弓低至高,無(wú)明顯側(cè)線。2 齡幼蟲蠕蟲形,頭區(qū)略縊縮,無(wú)環(huán)紋,口針細(xì)長(zhǎng),椎體部與桿部分界明顯,基部球大而圓,尾部透明區(qū)明顯,末端鈍圓(圖1～2)。其J2和雌蟲的形態(tài)測(cè)量值與Yang報(bào)道的象耳豆根結(jié)線蟲稍有差異[3],主要表現(xiàn)在J2口針較長(zhǎng),體寬較大,尾部稍短,而雌蟲體寬大于Yang描述的象耳豆根結(jié)線蟲雌蟲體寬。J2及雌蟲主要形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表1。

圖1 象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲及雌蟲形態(tài)Fig.1 Morphology of the second-stage juveniles and female of Meloidogyne enterolobii

圖2 象耳豆根結(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋Fig.2 Female perineal pattern of Meloidogyne enterolobii

病原線蟲Nematode蟲態(tài)Stage體長(zhǎng)/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針長(zhǎng)/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾長(zhǎng)/μmTaillength辣椒上病原線蟲Pathogenicnematodeonpepper2齡幼蟲The2ndjuveniles434.5(387.7～507.8)17.3(15.0～21.1)14.4(13.4～15.3)3.8(2.9～5.4)50.9(45.8～58.2)雌蟲Female630.3(486.7～821.3)623.8(283.8～687.5)15.9(12.6～16.4)5.2(3.7～6.2)—

續(xù)表1 Table 1(Continued)

病原線蟲Nematode蟲態(tài)Stage體長(zhǎng)/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針長(zhǎng)/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾長(zhǎng)/μmTaillength象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii2齡幼蟲The2ndjuveniles436.6(405.2～472.9)15.3(13.9～17.8)11.7(10.8～13.0)3.4(2.8～4.3)56.4(41.9～63.4)雌蟲Female735.0(541.3～926.3)606.8(375.7～809.7)15.1(13.2～18.0)4.9(3.7～6.2)—

1) 表中象耳豆根結(jié)線蟲的數(shù)據(jù)引自Yang,1983。

The data ofM.enterolobiiwas cited from Yang,1983.

2.2 同工酶分析

已知南方根結(jié)線蟲Est和MDH酶帶分別為H1和N1型[8]。對(duì)辣椒病株上分離的根結(jié)線蟲群體的Est和MDH同工酶圖譜(圖3)分析表明，該病原線蟲Est有2條主要酶帶,為VS1-S1型,MDH有1條酶帶,為N1a型,這與報(bào)道的象耳豆根結(jié)線蟲酶帶譜型一致[1]。所以根據(jù)病原線蟲Est-MDH表型圖譜,初步判定從湖南永州地區(qū)辣椒上分離到的根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲。

圖3 南方根結(jié)線蟲和辣椒上病原線蟲的Est和MDH同工酶圖譜Fig.3 The esterases(Est) and malate dehydrogenase(MDH) phenotypes of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

2.3 分子生物學(xué)分析

利用線蟲ITS序列通用引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,南方根結(jié)線蟲及分離獲得的病原線蟲都得到800 bp左右條帶(圖4a),將該病原線蟲擴(kuò)增序列割膠回收后送華大基因測(cè)序,在GenBank中BLAST,結(jié)果表明，該病原線蟲的ITS序列與象耳豆根結(jié)線蟲同源性達(dá)99%。

利用象耳豆根結(jié)線蟲IGS2序列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分離的病原線蟲擴(kuò)增到236 bp目的片段(圖4b),與Long等[12]報(bào)道的片段大小一致,其序列與象耳豆根結(jié)線蟲同源性為100%,而南方根結(jié)線蟲沒(méi)有擴(kuò)增到特異性目的條帶。

圖4 南方根結(jié)線蟲與辣椒上病原線蟲ITS-PCR及IGS-PCR 結(jié)果Fig.4 The results of ITS-PCR and IGS-PCR of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

3 結(jié)論與討論

本研究從比較形態(tài)學(xué)、同工酶電泳以及分子生物學(xué)方面對(duì)湖南永州地區(qū)感病辣椒植株上分離的病原線蟲進(jìn)行了種類鑒定。結(jié)果表明,該病病原線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲。據(jù)報(bào)道,在我國(guó)象耳豆根結(jié)線蟲僅在海南、廣州地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1,4,13],在湖南未曾報(bào)道有象耳豆根結(jié)線蟲的分布。本研究表明,從湖南永州地區(qū)感病辣椒植株上分離的根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲,這是除海南、廣州外又一地區(qū)發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲。卓侃等曾推測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲在我國(guó)南方亞熱帶、熱帶地區(qū)可能有較廣的分布[1],本研究是對(duì)其推測(cè)結(jié)果的一個(gè)有力證明,這對(duì)了解象耳豆根結(jié)線蟲的分布情況及其潛在危險(xiǎn)具有非常重要的意義。

辣椒是湖南廣泛栽培的蔬菜品種之一,在以往的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)湖南地區(qū)根結(jié)線蟲種類主要為南方根結(jié)線蟲[14],其在湖南對(duì)辣椒的侵染并不嚴(yán)重,未見(jiàn)引起明顯的產(chǎn)量損失。而從湖南永州地區(qū)感病辣椒植株上分離的根結(jié)線蟲種群對(duì)辣椒侵染率極高,發(fā)病地塊病株率達(dá)100%,感病辣椒萎蔫嚴(yán)重,出現(xiàn)明顯早衰,產(chǎn)量損失極大。象耳豆根結(jié)線蟲種群在湖南地區(qū)的發(fā)現(xiàn),為有效采取檢疫、防治措施,防止該病原線蟲的傳播擴(kuò)散及其危害提供必要的依據(jù)。而象耳豆根結(jié)線蟲是否會(huì)成為湖南地區(qū)繼南方根結(jié)線蟲后的又一重大根結(jié)線蟲病原,還有待于進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

First report ofMeloidogyneenterolobiion pepper in Hunan Province

Wang Jian1, Song Zhiqiang2, Cheng Feixue2, Cheng Ju’e2, Zhang Deyong2, Liu Yong2

(1. Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 2. Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops in Hunan Province, Changsha 410125, China)

The root-knot nematodes on pepper collected from Yongzhou， Hunan Province were identified by using morphological characters, isozymes and IGS-PCR. The results suggested that the root-knot nematodes wereMeloidogyneenterolobii. It was the first report ofMeloidogyneenterolobiiin Hunan Province.

Meloidogyneenterolobii； pepper； identification； Hunan Province

2014-04-18

2014-07-31

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103018)

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.035

* 通信作者 E-mail:dyzhang@163.com, haoasliu@163.com