Fusariumboothii特異性PCR檢測方法的建立與應用

潘 逸, 張 昊, 羅 文, 徐 進, 許景升, 馮 潔

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

?

Fusariumboothii特異性PCR檢測方法的建立與應用

潘 逸, 張 昊, 羅 文, 徐 進, 許景升, 馮 潔*

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

根據報道的Fusariumspp.的reductase-like基因序列,設計合成了1對用于Fusariumboothii的特異性檢測引物F-Fg/R-Fg。利用該對引物對包括F.boothii在內的35株鐮刀菌的基因組DNA進行了擴增。結果表明:該引物特異性強,僅從F.boothii基因組DNA中擴增出300 bp左右的特異性條帶,其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶;靈敏度驗證結果表明,該檢測法可以檢測出50 pgF.boothii基因組DNA。

鐮刀菌; 特異性檢測; 聚合酶鏈式反應;Fusariumboothii

由鐮刀菌(Fusarium) 引起的赤霉病是麥類作物的重要病害,廣泛分布于世界濕潤和半濕潤地區[1]。最近十幾年來,小麥赤霉病在亞洲、歐洲、加拿大和美國北部等地頻繁暴發[2],危害嚴重。在我國,長江流域是小麥赤霉病的傳統流行區,而近年來小麥赤霉病在北方麥區發生也越來越頻繁,對小麥生產造成嚴重威脅[3]，不僅引起小麥產量損失, 而且感病谷粒被真菌毒素污染,使人畜的健康安全受到嚴重威脅。

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearumsensu lato)是引起小麥赤霉病的主要病原菌,根據EF1α、reductase-like基因等13個功能基因系統發育分析結果,目前認為該菌是一個至少包含有15個種的復合種(Fusariumgraminearumspecies complex, FGSC),這些種很難通過形態學進行區分[4]。F.boothii是FGSC中的一個種,在亞洲、非洲和美洲都有一定分布,在玉米和小麥中均有報道[5-7]。任旭通過對多個基因的單核苷酸多態性(SNP)位點分型對玉米穗腐病菌進行鑒定,發現我國玉米穗腐病菌中存在少量的F.boothii[8]。目前,鑒定F.boothii主要采用多位點基因分型法[2]、EF1α基因序列分析[9]2種方法,但均成本較高且耗時較長。因此,亟需開發快速、穩定的檢測方法。

真菌的某些基因序列,如 ITS序列、β-tublin(TUB)基因、cox2基因等,在種內不同菌株間具有高度的保守性,但在屬間和屬內不同種間存在著豐富的多態性,利用這一特性進行PCR擴增、測序及序列分析后再設計特異性引物來進行植物病原真菌的分子檢測是目前被廣泛接受的一種技術,該技術憑借其快速、準確、重演性好的優點已經成為植物病原檢測的核心技術,得到越來越廣泛的應用[10]。

本研究旨在建立F.boothii的種特異性PCR檢測技術,從而能夠快速、低成本地檢測小麥赤霉病菌群體,監測F.boothii的種群分布及動態變化。

1 材料與方法

1.1 材料

35株供試菌株分屬于28種鐮刀菌，相關信息見表1。

1.2 鐮刀菌基因組DNA的提取

取少許菌絲接種于PDA平板中央,每個菌株接種2個平板,28 ℃恒溫培養5 d,待菌絲長滿平板。刮取2個平板的菌絲裝入2 mL離心管,放入烘箱里50 ℃過夜干燥。離心管中加入少量石英砂和一個玻璃珠,蓋上蓋子放入Mini-Beadbeater-96研磨儀模塊,用液氮冷凍后裝入研磨儀研磨100 s。采用OMEGA公司E.Z.N.A. Fungal DNA Kit (D3390) 提取菌株DNA,DNA于-20 ℃保存。

1.3 特異性引物的設計

對GenBank中已報道的F.boothii和其他多種鐮刀菌的reductase-like基因部分序列(GenBank登錄號見表1)進行序列比對分析,尋找F.boothii種特異性SNP位點。利用PrimerPremier 5設計特異性PCR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 反應體系與程序

PCR反應體系(20 μL):DNA模板1 μL,10 μmol/L引物各1 μL,20%PVP (W/V) 1 μL,2% BSA (W/V) 1 μL,2×PCR mix 10 μL,無菌水5 μL。

PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;最后72 ℃延伸10 min。

1.5 引物特異性驗證

以表1所示菌株基因組DNA為模板,用特異性引物F-Fg/R-Fg進行PCR擴增,反應體系及程序見1.4,設置水為模板的陰性對照,擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結果。

1.6 引物靈敏度驗證

用核酸濃度測定儀(GE公司,NanoVue Plus) 測定F.boothii基因組DNA濃度,并將其稀釋為5 ng/μL、500 pg/μL、50 pg/μL、5 pg/μL、500 fg/μL、50 fg/μL、5 fg/μL,然后利用特異性引物F-Fg/R-Fg,按1.4的反應體系和程序分別對稀釋的F.boothii基因組DNA進行PCR擴增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結果。

表1 引物F-Fg/R-Fg特異性驗證所用菌株及其PCR檢測結果1)

續表1 Table 1(Continued)

序號No.拉丁學名Latinname菌株編號aStrainno.寄主Host地理來源GeographicoriginGenBank登錄號bGenBankaccessionno.檢測cDetection16F.graminearumNRRL5883玉米Z.mays美國俄亥俄州Ohio,USAAF212566-17F.gerlachiiNRRL38380蘆竹Arundodonax美國中西部TheupperMidwestoftheU.S.DQ459794-18F.meridionale×F.asiaticumNRRL28721玉米Z.mays尼泊爾NepalAF212565-19F.lunulosporumNRRL13393葡萄柚Citrusparadisi南非SouthAfrica--20F.cerealisNRRL13721洋芋Solanumtuberosum波蘭PolandAF212575-21F.vorosiiNRRL38208小麥族TriticeaeDumort日本北海道Hokkaido,JapanDQ459797-22F.culmorumNRRL3288--AF212573-23F.pseudograminearumNRRL28062大麥H.vulgare澳大利亞AustraliaAF212578-24F.pseudograminearumNRRL28338土壤Soil澳大利亞AustraliaAF212581-25Fusariumsp.NRRL29380稗Echinochloa美國俄勒岡州Oregon,USAAY452927-26F.sporotrichioidesCBS448.67///-27F.acuminatumCBS334.75///-28F.verticillioidesCBS218.76///-29F.poaeCBS446.67///-30F.camptocerasCBS544.96///-31F.chlamydosporumCBS635.76///-32F.langsethiaeCBS121451///-33F.solaniCBS224.34///-34F.louisianenseCBS127524///-35F.nepalenseCBS127503///-

1) a: NRRL為美國菌種保藏中心標準菌株，CBS為荷蘭皇家藝術與科學院真菌多樣性研究中心標準菌株；b: reductase-like基因部分序列在GenBank登錄號;c: “+”表示檢測結果陽性，“-”表示檢測結果陰性。a: NRRL, Agricultural Research Service Culture Collection, CBS, Fungal Biodiversity Centre, the Institute of Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences; b: Only a part of reductase-like gene sequences are registered in GenBank；c: “+”means positive,“-”means negative.

2 結果與分析

2.1 特異性引物設計

根據Fusariumspp.的reductase-like基因序列的比對分析結果,設計了檢測F.boothii的特異性引物F-Fg/R-Fg(F-Fg：5′-ATGGGTAAGGAGACAAGAC-3′；R-Fg:5′-GGAGTACCAGTATCATGTT-3′),目的片段大小約為300 bp。

2.2 引物特異性驗證

以表1所示菌株DNA為模板,用特異性引物F-Fg/R-Fg進行PCR擴增,電泳檢測結果顯示:該引物僅從F.boothii的基因組DNA中擴增出1條300 bp左右的特異性條帶,與預期結果一致,而其他33種參照菌株和陰性對照均無任何條帶(圖1)。特異性檢測結果表明,所設計的引物具有種間相對特異性,能夠區別F.boothii與Fusarium屬其他病原真菌。

圖1 引物F-Fg/R-Fg特異性擴增Fusarium boothiiFig.1 Specificity validation of F-Fg/R-Fg

2.3 引物靈敏度驗證

用特異性引物F-Fg/R-Fg分別對不同濃度的F.boothii基因組DNA進行擴增,設置無菌水為模板的陰性對照,結果顯示:隨著模板濃度的降低,瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度逐漸變暗,模板量為50 pg時還能分辨出1條約300 bp的特異性條帶(圖2),而模板量小于50 pg以及無菌水對照均無明顯的擴增產物,說明該引物的靈敏度為50 pg。

圖2 引物F-Fg/R-Fg靈敏度驗證Fig.2 Sensitivity validation of F-Fg/R-Fg

3 討論

鐮刀菌屬真菌含有多個種,利用形態學方法鑒定比較復雜,而且禾谷鐮刀菌復合種內的各個種很難通過形態學進行區分。目前，F.boothii鑒定方法成本較高,不適于大樣本篩查。PCR檢測技術在真菌中的應用已很廣泛,具有低成本、穩定性高的優點,因此開發F.boothii的常規PCR檢測方法是十分必要的。

本研究通過對報道的鐮刀菌的reductase-like基因序列進行同源性比對分析,設計合成了1對用于F.boothii檢測的特異性引物F-Fg/R-Fg。利用該引物對包括F.boothii在內的35株鐮刀菌菌株的基因組DNA進行了PCR擴增,結果表明:該引物特異性強,僅從F.boothii基因組DNA中擴增出1條300 bp左右的特異性條帶,其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶。該檢測法適用范圍廣,穩定性和準確性高。

[1] Nganje W E, Bangsund D A, Leistritz F L, et al. Estimating the economic impact of a crop disease: The case ofFusariumhead blight in U.S. wheat and barley [C]∥National Fusarium Head Blight Forum Proceedings, 2002：275-281.

[2] Ward T J, Clear R M, Rooney A P, et al. An adaptive evolutionary shift inFusariumhead blight pathogen populations is driving the rapid spread of more toxigenicFusariumgraminearumin North America [J].Fungal Genetics and Biology, 2008, 45(4): 473-484.

[3] Zhang Hao, Van der Lee T, Waalwijk C, et al. Population analysis of theFusariumgraminearumspecies complex from wheat in China show a shift to more aggressive isolates[J].PLoS ONE, 2012, 7(2): e31722.

[4] Sarver B A J, Ward T J, Gale L R, et al. NovelFusariumhead blight pathogens from Nepal and Louisiana revealed by multilocus genealogical concordance [J].Fungal Genetics and Biology, 2011, 48(12): 1096-1107.

[5] Boutigny A L, Ward T J, Van Coller G J, et al. Analysis of theFusariumgraminearumspecies complex from wheat, barley and maize in South Africa provides evidence of species-specific differences in host preference [J].Fungal Genetics and Biology, 2011, 48(9): 914-920.

[6] Desjardins A E, Proctor R H. Genetic diversity and trichothecene chemotypes of theFusariumgraminearumclade isolated from maize in Nepal and identification of a putative new lineage [J].Fungal Biology, 2011, 115(1): 38-48.

[7] Sampietro D A, Diaz C G, Gonzalez V, et al. Species diversity and toxigenic potential ofFusariumgraminearumcomplex isolates from maize fields in northwest Argentina [J].International Journal of Food Microbiology, 2011, 145(1): 359-364.

[8] 任旭.我國玉米穗腐病主要致病鐮孢菌多樣性研究[D].北京:中國農業科學院, 2011.

[9] Geiser D M, Jimenez-Gasco M D, Kang S C,et al. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifyingFusarium[J].European Journal of Plant Pathology,2004,110:473-479.

[10]王娜,馬雅軍,王喆之,等.PCR相關技術方法在植物病害檢測中的應用(綜述)[J].上海農業學報,2004,20(4):112-115.

(責任編輯：楊明麗)

Establishment and application of PCR for detection ofFusariumboothii

Pan Yi, Zhang Hao, Luo Wen, Xu Jin, Xu Jingsheng, Feng Jie

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

A pair of species-specific primers F-Fg/R-Fg was designed for detection ofFusariumboothiibased on reductase-like gene sequences ofFusariumspp. A total of 35 strains ofFusariumwere tested by using the primers, the results showed that the F-Fg/R-Fg were of high specificity, since only a single product of about 300 bp was amplified fromFusariumboothiigenomic DNA. The sensitivity of the detection was 50 pg genomic DNA per 20 μL PCR reaction volume.

Fusarium; detection; PCR;Fusariumboothii

實驗方法與技術ExperimentalMethod&Technology

2014-05-12

2014-06-20

公益性行業(農業)科研專項(201303016)；國家國際合作專項(2013DFG31930)；國家自然科學基金(31201477)

S 435.121.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.022

* 通信作者 E-mail: jfeng@ippcaas.cn