疊層自組裝技術在根面構建緩釋系統的研究

張弘岑 蓮汪俊

·論著·

疊層自組裝技術在根面構建緩釋系統的研究

張弘岑 蓮汪俊

目的使用疊層自組裝技術在牙根面構建外源性蛋白緩釋系統。方法收集離體下頜第二前磨牙18顆，隨機分為6組，a-e組為實驗組，進行酸蝕處理；f組為對照組，不作酸蝕處理。各組在不同條件下進行疊層自組裝實驗，于第1～9天收集樣本液，檢測吸光度并計算蛋白釋放濃度。結果各組樣本蛋白均有持續性釋放，各組內均呈現緩慢釋放的趨勢（P＜0.05）。酸蝕處理組蛋白釋放量顯著高于對照（P＜0.05）；隨著原料中蛋白濃度增加，其釋放量及緩釋速率提高（P＜0.05）；隨吸附次數的增加，蛋白釋放量也提高（P＜0.05），緩釋速率基本不變，但釋放維持時間延長。結論疊層自組裝技術能有效地在根面構建外源性蛋白的緩釋系統。

疊層自組裝技術根面處理緩釋系統蛋白吸附

牙根表面覆蓋有足夠的活性牙周膜細胞是牙再植成功的關鍵[1]。研究證實，根面牙周膜細胞移植可明顯改善全脫位牙再植的預后[2-4]。但細胞移植存在諸多缺點，不利于其臨床轉化。隨著組織工程和再生醫學的發展，通過誘導內源性干細胞歸巢促進組織再生修復已成為一種新的治療理念，并在多個醫學領域得到了證實[5-7]。我們的前期研究發現，通過浸泡法，在延時再植的比格犬前磨牙根面加載外源性趨化因子能夠出現一定程度的牙周再生，但再生的成功率并不高[8]。究其原因，可能是由于牙根面很光滑，不利于外源因子的吸附，無法作為趨化因子緩釋載體。為此，本實驗擬應用疊層自組裝技術（Layerby-Layer self-assembly technique，LbL）在牙根面構建外源性蛋白質的緩釋系統。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、檸檬酸（生工生物工程股份有限公司），明膠（Sigma，美國），藻酸鈉（Sigma，美國）。紫外-可見吸收光譜儀（BWTEK，美國）。

1.2 繪制標準曲線

配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0mg·mL-1的BSA溶液，紫外-可見吸收光譜儀檢測，并記錄280 nm吸光度，繪制標準曲線。

1.3 制備根片

收集牙根大小、形態相似的離體健康下頜第二前磨牙18顆，隨機分為a～f共6個組，每組3顆。去凈牙周膜并截冠，流動樹脂封閉根管口及根尖孔，透明指甲油封閉截面。

1.4 配制試劑

室溫下配制30%的新鮮檸檬酸。40℃環境下配制0.1%的明膠溶液，冷卻至室溫。室溫下配制0.1%藻酸鈉溶液，加入BSA，分別配成濃度為0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的藻酸鈉-BSA溶液。

1.5 LbL吸附實驗

a～e組為實驗組，牙根置于30%檸檬酸中，超聲環境下浸泡30 min；f組為對照組，牙根置于生理鹽水中，超聲環境下浸泡30 min。取出牙根，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次。

各組牙根分別浸泡于10 m L 0.1%明膠溶液中，勻速震蕩10 min，PBS沖洗2次，再浸泡于10 m L不同濃度的藻酸鈉-BSA溶液中，靜置10 min，PBS沖洗2次。將此步驟記為1次LbL吸附（表1）。

表1 樣本分組及處理方式Table.1 G rouping and treatment of the specim ens

1.6 檢測BSA釋放量

將上述各組牙根分別置于10 m L生理鹽水中，室溫靜置。分別于1～9 d時收集各組樣本液5 mL，即刻檢測280 nm吸光度，重復測量3次。計算累積濃度，繪制曲線圖。

1.7 統計學分析

采用SAS 9.2統計軟件進行統計分析，組內各時間點累積濃度的差異和組間處理因素的差異（根面酸蝕處理、原料BSA濃度、吸附次數以及是否包覆明膠薄膜）使用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BSA吸光度標準曲線

對各濃度生理鹽水-BSA溶液進行紫外-可見吸收光譜儀檢測，并記錄280 nm吸光度，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 280 nm處生理鹽水-BSA的吸光度標準曲線Fig.1 The standard curve of absorbance of saline-BSA at 280 nm

2.2 BSA釋放量

測定各組各時間點對應的樣本液累積濃度，結果顯示各組樣本在實驗時間內均有持續性釋放，其中a、b、c三條曲線在6～7 d后逐漸趨于平緩，而d、e、f三條曲線到9 d時仍能保持相對恒定的釋放速率（圖2）。

圖2 各組樣本隨時間的BSA釋放濃度均值曲線Fig.2 The average curve of BSA release concentration in each sam ple

本實驗各組樣本均呈現緩慢釋放的趨勢（P＜0.05），表明疊層自組裝技術能夠有效地在牙根表面構建外源性蛋白緩釋系統，吸附BSA并持續性釋放。

BSA釋放濃度均值曲線顯示，曲線d明顯高于曲線f，趨勢分析與組間差異均具有顯著差異（P＜0.05），表明未經處理的牙根表面使用LbL技術也能夠吸附上BSA，但酸蝕處理能夠顯著提高其釋放量。

a、b、c三條曲線走勢相似，趨勢分析與組間差異均具有統計學意義（P＜0.05），表明當吸附次數一定（均為2次）時，LbL所用原料中BSA的濃度能夠影響其釋放量，在一定范圍內隨濃度增加，釋放量及緩釋速率也提高。

曲線b在6～7 d后趨于平緩，而曲線d在9 d時仍然保持較為恒定的釋放速率，趨勢分析與組間差異均具有統計學意義（P＜0.05），表明原料中BSA濃度一定時，隨LbL吸附次數的增加其釋放量也提高，緩釋速率基本不變，但釋放時間延長。

d、e兩條曲線基本重疊，趨勢分析差異具有統計學意義（P＜0.05），但組間差異無顯著性（P＞0.05），表明在最外層包覆明膠薄膜能夠影響各時間點的BSA釋放量，但不足以對整體釋放水平造成顯著性改變。

3 討論

本實驗首次將疊層自組裝技術應用于延時再植牙的研究。該技術是一種生理多功能性納米薄膜制造技術[9]，在眾多自組裝方法之中，分子沉積自組裝的應用最為廣泛，其原理是使帶有相反電荷的材料（聚陽離子和聚陰離子）交替沉積[10]，常在生物及生物材料領域用于攜帶藥物以達到緩釋作用。

研究證實，使用酸蝕劑對牙根面進行酸蝕處理能暴露膠原纖維，使根面呈微孔結構[11-12]，這種微觀形貌可提高牙周細胞對根面的黏附和增殖能力[13]，還可提供天然的支架結構，利于外源性因子的緩釋。此外，酸蝕處理能改善根面的生物相容性，促進外源性因子的吸附[11-12]。常見的根面酸蝕處理劑有30%檸檬酸、24%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）和37%磷酸[14]。其中，30%檸檬酸因其有效的去污能力得到廣泛應用[15]。我們的前期實驗證實，以30%檸檬酸在超聲環境下浸泡30 min能夠簡便有效地暴露根面膠原纖維網，故本實驗中均采用這一方法。其作用機制可能是經酸蝕處理的根面膠原纖維暴露，一方面增加了牙根表面面積，另一方面纖維網中密集的孔隙提供了聚電解質吸附的通道，進而提高了整個牙根對蛋白質的吸附能力。

本實驗使用LbL技術在根面加載外源性蛋白質并檢測其持續釋放效果。結果表明，LbL技術能夠簡便有效地在牙根表面構建外源性蛋白的緩釋系統，吸附BSA并達到緩釋作用，根面酸蝕處理能夠提高蛋白的釋放量，不同的組裝條件也會影響蛋白釋放情況。由于細胞因子是蛋白質類物質，故本實驗提供了一種在根面加載細胞因子的新型方法，但其在延時再植中的具體臨床意義還需細胞因子吸附實驗及體內實驗進一步證實。

[1]Lang H,Schüler N,Nolden R.Attachment formation following replantation of cultured cells into periodontal defects-a study in minipigs[J].J Dent Res,1998,77(2):393-405.

[2]Wang Y,Cheung GS,Xu X,et al.The effect of cultured autologous periodontal ligament cells on the healing of delayed autotransplanted dog's teeth[J].J Endod,2010,36(2):264-267.

[3]Zhou Y,Li Y,Mao L,et al.Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model[J].Arch Oral Biol,2012,57(2):169-176.

[4]Müller R,Lengerke C.Patient-specific pluripotent stem cells: promises and challenges[J].Nat Rev Endocrinol,2009,5(4):195-203.

[5]Chen FM,Zhang J,Zhang M,et al.A review on endogenous regenerative technology in periodontal regenerative medicine[J]. Biomaterials,2010,31(31):7892-7927.

[6]Schenk S,Mal N,Finan A,et al.Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor[J].Stem Cells,2007,25(1):245-251.

[7]Chen FM,Wu LA,Zhang M,et al.Homing of endogenous stem/ progenitor cells for in situ tissue regeneration:Promises,strategies, and translational perspectives[J].Biomaterials,2011,32(12):3189-3209.

[8]朱文婷.根面處理促進延時再植全脫位牙牙周愈合的研究[D].上海:上海交通大學醫學院,2011.

[9]Decher G,Hong J,Schmitt J.Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process:Iii.Consecutively alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces[J].Thin Solid Films,1992,210:831-835.

[10]Li W,Guan T,Zhang X,et al.The effect of layer-by-layer assembly coating on the proliferation and differentiation of neural stem cells[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(5):3018-3029.

[11]Mine K,Kanno Z,Muramoto T,et al.Occlusal forces promote periodontal healing of transplanted teeth and prevent dentoalveolar ankylosis:an experimental study in rats[J].Angle Orthod,2005, 75(4):637-644.

[12]Crigger M,Renvert S,Bogle G.The effect of topical citric acid application of surgically exposed periodontal attachment[J].J Periodont Res,1983,18(3):303-305.

[13]Biggs MJ,Richards RG,McFarlane S,et al.Adhesion formation of primary human osteoblasts and the functional response of mesenchymal stem cells to 330nm deep microgrooves[J].J R Soc Interface,2008,5(27):1231-1242.

[14]Amaral NGD,Rezende MLRD,Hirata F,et al.Comparison among four commonly used demineralizing agents for root conditioning: A scanning electron microscopy[J].J App l Oral Sci,2011,19(5): 469-475.

[15]Labahn R,Fahrenbach WH,Clark SM,et al.Root dentin morphology after different modes of citric acid and tetracycline hydrochloride conditioning[J].J Periodontol,1992,63(4):303-309.

Layer-by-layer Self-assembly Coating in the Construction of Sustained Release System on Root Surface

ZHANG Hong1,CEN Lian2,WANG Jun1.
1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China.Corresponding author:WANG Jun(E-mail:wangjun202@hotmail.com).

Objective To construct a sustained release system of exogenous protein on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.M ethods Eighteen healthy mandibular second premolars were collected and randomly divided into 6 groups,group a-e were experimental groups with acid etching,group f was a control group without etching.Each group went through layer-by-layer adsorption experiments under different conditions.Samp les were collected and detected absorbance on day 1-9 in each group to calculate the concentration of protein release.Results All sets of samples showed sustained-release trend(P＜0.05).Etching group showed a significant increase of protein release compared with control group(P＜0.05);Release rate and amount increased with the protein concentration in the materials(P＜0.05); More adsorption times leaded to larger release amount and prolonged time(P＜0.05).Conclusion Sustained release system of exogenous protein can be constructed on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.

Layer-by-Layer;Root surface conditioning;Sustained release system;Protein absorption

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）03－0121－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.001

2015年4月3日；

2015年5月11日）

上海市科委醫學引導項目（124119b0101）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院兒童口腔科（張弘，汪俊）；200237上海市華東理工大學化工學院（岑蓮）。

汪俊（E-mail:wangjun202@hotmail.com）。