新痹痛靈對小鼠免疫功能的影響

劉 晏，魏 剛，朱豐林，郭云柯，平 凡，景嶸月，陸兔林，郭海英，汪 悅

（南京中醫藥大學，南京210029）

新痹痛靈對小鼠免疫功能的影響

劉 晏，魏 剛，朱豐林，郭云柯，平 凡，景嶸月，陸兔林，郭海英，汪 悅*

（南京中醫藥大學，南京210029）

目的 觀察新痹痛靈對小鼠免疫功能的影響。方法 將小鼠隨機分為空白組、陽性藥組、新痹痛靈低劑量組、新痹痛靈高劑量組，通過計算廓清指數，觀察新痹痛靈對小鼠非特異性免疫方面的影響；采用血清溶血素試驗法以及二硝基氯苯誘導的遲發型超敏反應試驗法，觀察新痹痛靈在特異性免疫方面的作用。結果 新痹痛靈能調整小鼠的碳粒廓清吞噬指數、減少血清溶血素抗體的生成、抑制遲發型超敏反應的發生。結論 新痹痛靈能不同程度的在非特異性免疫和特異性免疫兩個方面有免疫抑制作用。

新痹痛靈；免疫功能；碳粒廓清；溶血素；遲發型超敏反應

新痹痛靈是從全國名老中醫汪履秋教授治療中醫“痹證”（尤其是類風濕關節炎）的經驗方變化而來，由朱丹溪上中下通用痛風方化裁，在結合了前期的實驗及臨床研究后總結而出［1-4］。為進一步研究新痹痛靈對免疫系統的調節機制，本實驗分別從非特異性免疫和特異性免疫兩個方面，對新痹痛靈進行了實驗研究。報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級BALB／C、ICR雄性小鼠（血清溶血素試驗使用ICR小鼠，其余試驗采用BALB／C小鼠），體質量（20±2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXX（京）2012-0001。豚鼠（200±20）g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物許可證號：SCXX（蘇）2012-0008。實驗動物均飼養在SPF級動物房，室內溫度（22±1）℃，濕度（55±5）% ，12 h光暗循環。實驗動物飼養時間均大于1周，其飼料和水在消毒后均由動物自由攝取。

1.2 藥物、試劑與制備 新痹痛靈藥材購于江蘇省中醫院門診部藥房，制作程序由南京中醫藥大學藥學院研制，經江蘇省中醫院制劑部加工。具體提取方法：本方共6味藥，取桂枝、防風用10倍量水浸泡2 h，水蒸汽蒸餾6 h，提取揮發油，收集揮發油、水提液及藥渣以備用。取麻黃、青風藤用16倍量50%乙醇提取3次，每次2 h，合并醇提液，過濾、收集醇提液及藥渣以備用。最后將以上4味藥藥渣合并另2味藥一同加入20倍量水中，提取2次，2 h／次，合并水煎液，與之前備用的揮發油水提液合并，加乙醇至含醇量50% ，靜置48 h，上清液與醇提液合并，減壓回收乙醇至無醇味的清膏，折合原藥材為每1g浸膏含生藥量為10.75 g。雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司，生產批號1403111B）。

試劑及配置：印度墨汁，Solarbio公司生產，批號08C021；二硝基氯苯（簡稱DNCB），SIGMA公司生產，批號C3762；伊文斯藍，SIGMA提供，批號E2129；30% BrijL23 solution，SIGMA公司生產，批號SLBH6355V；都氏試劑，SIGMA公司生產，批號SLBF9046V，臨用時以1 VL∶1 000 mL雙蒸水稀釋成都氏溶液，然后加入0.5 mL的30%BrijL23溶液備用。

綿羊紅細胞（SRBC，玉環縣南方試劑廠生產，批號NF-242），臨用前用生理鹽水洗滌，2 000 r／min條件下離心5 min，棄用上清液，如此洗滌3次，最后以體積比3∶5用生理鹽水稀釋備用；豚鼠血清制備：取3只豚鼠血，離心后取血清，并在-20℃中保存，使用之前用生理鹽水1∶10稀釋。

1.3 儀器 酶標儀，PerKin Elmer生產，批號：23000353；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司生產；5810型臺式大容量高速離心機，德國eppendortf公司生產。

2 方法

2.1 分組與給藥 雄性ICR小鼠分為空白組、陽性藥組、痹痛靈低劑量組、痹痛靈高劑量組，每組10只，分別予生理鹽水0.2 mL／10 g，雷公藤多苷片溶液0.012 g／kg，新痹痛靈浸膏溶液3.95、15.8 g生藥／kg體質量。

2.2 對非特異性免疫功能的影響——碳粒廓清實驗［5］連續給藥7 d，末次給藥30 min后，從小鼠尾靜脈以0.1 mg／10 g體質量注射印度墨汁（印度墨汁用前以生理鹽水稀釋10倍），分別于0.5、6 min從右眼眶后靜脈叢取血0.1 mL，再用移液器取25 μL溶于2 mL0.1%NA2CO3溶液中，充分洗出吸管壁附著之血液，搖勻。實驗結束前取一空白小鼠血液25 μL，溶于2 mL 0.1%NaCO3液校零，酶標儀600 nm得出OD值即吞噬速率。最后將小鼠脫臼處死，分別稱取肝脾重量，計算廓清指數K和吞噬指數α。

2.3 對特異性免疫功能的影響——溶血素實驗［6］連續給藥7 d，給藥第1天后于BALB／C小鼠腹腔注射20%SRBC 0.2 mL／只，第7天給藥后1 h眼眶取血，分離血清，以NS稀釋200倍后供測定。反應管內依次加入經稀釋的小鼠血清1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%豚鼠血清1 mL，對照管內1次加入生理鹽水1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%豚鼠血清1 mL。兩管均置于37℃恒溫水浴中保溫10 min，然后移至冰浴中終止反應，2 000 r／min離心10 min，取上清液1 mL加入3 mL都氏試劑；另取一管，加入4 mL都氏試劑和0.25 mL 5%SRBC，各試管搖勻放置10 min，酶標儀（540 nm分別測定各管吸收度值OD）。計算公式：HC 50＝樣品的吸光度值／SRBC半數溶血值×稀釋倍數。

2.4 對特異性免疫功能的影響——遲發型超敏反應實驗［7-8］首次給藥后以脫毛劑去ICR小鼠背部頸毛，第2天用移液器在給藥組頸部皮膚上滴50% DNCB丙酮溶液2 μL／只致敏；空白組涂PBS溶液作為對照。連續給藥12 d，于末次給藥后1 h，在脫毛后的小鼠腹部皮膚上用20 μL的2.5%DNCB丙酮溶液進行攻擊；24 h后（第13天），按照0.01 mL／g的計量，給每只小鼠尾靜脈注射1%的伊文斯藍，注射30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，取下腹部藍染皮膚剪碎，置于試管中，用5 mL的1∶1丙酮生理鹽水混合液浸泡，24 h后（第14天）以3 000 r／min離心10 min，取上清液處比色，酶標儀（610 nm）測吸光度OD值。

2.5 統計學方法 所有實驗數據均用SPSS 19.0軟件，組間比較采用χ2分析。

3 結果

3.1 碳粒廓清實驗結果 見表1。

3.2 溶血素實驗結果 見表2。

表1 新痹痛靈對小鼠廓清指數的影響（±s，n＝10）

表1 新痹痛靈對小鼠廓清指數的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05

組 別 K值 α值＃空白組 0．087±0．004 7．98±0．18陽性藥組 0．059±0．008＃ 6．71±0．35＃低劑量組 0．082±0．005＃ 7．44±0．13＃高劑量組 0．068±0．004＃ 7．23±0．17

表2 新痹痛靈對綿陽紅細胞所致小鼠溶血素抗體形成的影響（±s，n＝10）

表2 新痹痛靈對綿陽紅細胞所致小鼠溶血素抗體形成的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 HC50 組 別 HC50空白組 0．130 2±0．042 2 低劑量組 0．116 8±0．029 8＃＃陽性藥組 0．077 9±0．019 8＃＃ 高劑量組 0．087 9±0．021 5

3.3 遲發型超敏反應實驗結果 見表3。

表3 新痹痛靈對DNCB所致小鼠遲發型超敏反應的影響（±s，n＝10）

表3 新痹痛靈對DNCB所致小鼠遲發型超敏反應的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05

組 別 D（λ＝610nm） 組 別 D（λ＝610nm）空白組 0．1266±0．0172 低劑量組 0．0962±0．0121＃陽性藥組 0．0838±0．0191＃ 高劑量組 0．0836±0．0143＃

4 討論

血液中碳粒的消失速度可反應網狀內皮系統吞噬異物的能力，從而證明其防御功能的強弱［9］。本實驗選用碳粒廓清實驗體現新痹痛靈對正常小鼠非特異性免疫功能的影響。印度墨汁作為異物顆粒注射入血，被單核吞噬細胞迅速吞噬清除［10］。廓清指數（K）網狀內皮系統的巨噬細胞對異物的吞噬廓清能力和速度，吞噬指數（α）在排除了肝、脾重量對K值影響的情況下 ，反應了網狀內皮系統的功能狀態［11］。本實驗結果表明，新痹痛靈低、高劑量均對正常小鼠的廓清指數有顯著影響。

經綿羊紅細胞免疫的小鼠，其淋巴細胞可產生特異性的抗綿羊紅細胞抗體，然后釋放至外周血［12］。抗體在體外與綿陽紅細胞及補體一同溫浴 ，可發生溶血反應 ，并釋放出血紅蛋白［13］。通過測定溶血過程中釋放出的血紅蛋白量可以計算出致敏動物血清中溶血素的含量。而紅細胞的溶血程度又與抗體的含量呈正相關，故通過對上清液的光密度的測定，可間接測定抗體的數量［14］。結果表明，新痹痛靈低、高劑量均能降低血清溶血素含量，但高劑量的作用更為顯著。

DNCB是一種半抗原，其稀釋液可與小鼠腹部皮膚蛋白結合成完全抗原，從而刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，DNCB誘導的DTH模型對研究細胞免疫有重要意義［15-16］。本實驗在致敏12 d后進行抗原攻擊，將DNCB涂抹在皮膚，一般24～48 h反應達到高峰 ，用比色法對皮片的吸光度進行比較［17］。實驗結果表明，新痹痛靈能明顯抑制小鼠遲發型超敏反應，說明新痹痛靈對T淋巴細胞介導的特異性細胞免疫有一定抑制作用。

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Xinbitongling on mice immune function

LIU Yan，WEI Gang，ZHU Fenglin，GUO Yunke，PING Fang，JING Rongyue，LU Tulin，GUO Haiying，WANG Yue*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Objective To observe the effect of the New Bitongling on immune regulation in mice．Methods Mice are randomly divided into blank group，positive drug group，low dose of New Bitongling group and high dose of New Bitongling．Through calculating phagocytic index，effects of New Bitongling on non-specific immunomodulating effects on mice are observed．Hemolysin test and dinitrofluorobenzene-induced delayed type hypersensitivity test（DTH）are used to observe effects of New Bitongling on non-specific immunomodulating effects on mice．Results The New Bitongling Compound can decrease the index the number of K and α，reduce the generation of serum hemolysin antibody，and inhibit dinitrofluorobenzene-induced delayed type hypersensitivity reaction．Conclusion The New Bitongling Compound can suppress the two aspects of nonspecific immunity and specific immunity in mice in different degree．

Xinbitongling；immunologic function；carbon clearance test；hemolysin；DTH

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0908-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．009

2015-02-04）

國家中醫藥管理局中醫痹病學重點學科開放基金資助項目（BBXK2013106）；康緣中醫藥科技創新項目計劃（KZ1003KY）。

劉 晏（1989-），女，碩士研究生，主要從事中醫內科學風濕免疫臨床研究。

*通信作者：汪 悅，男，教授，博士研究生導師，電子信箱-wangyuephd＠126．com