冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對大鼠肝移植后免疫調節的影響

鄒佩霞，李 敏，李 莉，王文杰，陳德森*

（1．十堰市太和醫院兒科，湖北十堰442000；2．湖北醫藥學院，湖北十堰442000）

冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對大鼠肝移植后免疫調節的影響

鄒佩霞1，李 敏1，李 莉2，王文杰1，陳德森2*

（1．十堰市太和醫院兒科，湖北十堰442000；2．湖北醫藥學院，湖北十堰442000）

目的 觀察冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對大鼠減體積1／2肝臟移植后免疫調節功能的影響。方法 80只大鼠，隨機分為空白對照組、模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組，采用改良雙袖套法進行1／2大鼠同種異體減體積原位肝臟移植，術后硫唑嘌呤組用硫唑嘌呤稀釋溶液灌胃1.0 mg／（kg?d）、冬蟲夏草組用6%冬蟲夏草浸出液（10 mL／kg）加硫唑嘌呤1.0 mg／（kg?d）灌胃。于治療21 d后，測定肝微粒體細胞色素P450亞型酶（CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4）活性，血清總蛋白、白蛋白、血紅蛋白，靜脈血紅細胞、白細胞、T淋巴細胞、單核細胞數量，受體大鼠感染率。結果 冬蟲夏草浸出液明顯抑制存活受體大鼠P450亞型酶CYPIA2（0.68±0.09）、CYP3A4酶的活性（4.92±0.27），降低靜脈血紅細胞（6.71±0.87）、白細胞數量（10.36±0.09），提高血清總蛋白（19.39±4.93）、白蛋白（14.27±4.45）及血紅蛋白含量（19.39±4.973），明顯降低受體大鼠感染率40.87%。與硫唑嘌呤組比較，P＜0.05。對T淋巴細胞及單核細胞數量無明顯影響，與硫唑嘌呤組比較，P＞0.05。結論 冬蟲夏草浸出液在不影響硫唑嘌呤抑制肝移植排斥反應的同時，改善肝臟移植后低蛋白血癥，提高體液免疫，對細胞免疫功能無明顯影響，具有雙向免疫調節作用。

大鼠；冬蟲夏草浸出液；硫唑嘌呤；肝臟移植；免疫調節

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康SD大鼠80只，SPF級，9～l2周齡，體質量250～300 g，雌雄兼用，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物設施使用許可證SYXK（鄂）2014-0031，實驗動物生產許可證SCXK（鄂）2014-0008。采用隨機數字表編號，隨機分為空白對照組、模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組，每組20只，即供、受體和10只（對本組供、受體配對交叉原位1／2減體積肝移植）。

1.2 藥品試劑及儀器 硫唑嘌呤片（常州亞邦制藥有限公司，5mg／片，國藥準字：H20053413）；冬蟲夏草（購自十堰市太和醫院中藥房）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，德國進口分裝 ，批號：061222）；Waters2010型高效液相色譜儀（迪馬公司）；雙目連續變倍體視顯微鏡（上海嚴豐精密儀器有限公司，型號：YF501）；貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司，型號：AU5800）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市億通電子有限公司）；CAY-1型液體快速混合器（北京長安儀器廠）；顯微外科無損傷縫合線（寧波醫用縫針有限公司，規格：10／0）；GR22GⅡ型高速冷凍離心機（美國Beck-man公司）；KQ-500E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 大鼠肝臟移植手術方法 參照文獻［3］，每對供、受體大鼠體質量相差≤15 g，供體及受體術前均禁食12 h，不禁水。術前10 min肌肉注射阿托品0.04 mg，分別對模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組用2%戊巴比妥鈉（按45 mg／kg）麻醉。仰臥位固定，對同組供體及受體大鼠同時進行改良雙袖套法（“4貫通、3結扎、2回折法”）手術，為保證大鼠動、靜脈吻合精確，提高手術成功率，所有手術均在雙目連續變倍體視顯微鏡下進行。受體自身肝臟切除與供體1／2減體積相同，原位置入受體腹腔進行配對交叉肝臟移植。術后分層關閉腹腔，碘伏消毒創口1周（1次／d），頭孢克洛0.1 g，100 g／d肌肉注射預防感染（5 d），術后動物飼養應滿足動物福利要求，動物房溫度18～25℃，濕度50%～75%，大鼠單籠飼養，12 h交替光照使盡快復溫，動物蘇醒后自由飲水，普通飼料喂養，每日觀察動物進食情況，稱體質量，及時清理糞便，消毒護理時盡量減少動物的疼痛和不適等［4］。

1.4 冬蟲夏草浸出液提取及治療方法 參照文獻［5］，乙醇提取法：在攪拌槽內，將50 g按1∶2～8重量比加入50%～95%乙醇，提取時間為1～24 h，提取溫度為20～60℃；離心：將醇液與基質沉淀物進行固液分離，得到醇提液和沉淀物；醇提取液濃縮干燥：用減壓蒸餾方法將醇提液濃縮至漿狀，然后烘干，即得含蟲草素和蟲草酸的醇提物。使用時用注射用生理鹽水稀釋到6%，硫唑嘌呤用碾缽碾碎后用生理鹽水稀釋到1%。大鼠肝臟移植手術成功后，硫唑嘌呤組用1%硫唑嘌呤1.0 mL／（kg?d）灌胃；冬蟲夏草組用6%冬蟲夏草浸出液（10 mL／kg）加1%硫唑嘌呤1.0 mg／（kg?d）灌胃；對照組及模型組灌生理鹽水（按10 mL／kg）。連續治療21 d。

1.5 檢測指標 參照文獻［6］，在治療21 d后，選擇存活各組大鼠各10只，均經眶靜脈采取血0.5 mL，測定血清總蛋白、白蛋白、血紅蛋白，靜脈血紅細胞、白細胞，T淋巴細胞及單核細胞數量。動物斷頭處死取肝臟，4℃下9 000 r／min，離心20 min，取上清液肝微粒體體外孵育，37℃預孵育30 min，后取上清液用高效液相色譜儀進樣檢測CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。

1.6 統計學方法 數據處理采用SPSS 17.0統計軟件，各組數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較均采用 t檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬蟲夏草浸出液對肝微粒體細胞色素P450亞型酶的影響 見表1。

表1 冬蟲夏草浸出液對肝微粒體細胞色素P450亞型酶的影響（±s，n＝10） nmol／mL

表1 冬蟲夏草浸出液對肝微粒體細胞色素P450亞型酶的影響（±s，n＝10） nmol／mL

注：與模型組比較 ，＃P＜0．05；與空白對照組比較 ，△P＜0．05；與治療前比較，▲P＜0．05；與硫唑嘌呤組比較 ，☆P＜0．05

組 別 感染率／% CYPIA2 CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4對照組 治療前 0 1．57±0．15 2．34±0．13 4．58±0．15 1．57±0．13 6．59±0．25治療后 0 1．42±0．11 2．40±0．08 4．57±0．10 1．53±0．15 6．49±0．30模型組 治療前 1．53±0．17 2．38±0．15 4．57±0．12 1．54±0．14 6．55±0．21治療后 8（80．23） 2．45±0．19△▲ 2．43±0．21 4．61±0．20 1．55±0．21 10．50±0．39△▲硫唑嘌呤組 治療前 1．50±0．14 2．36±0．13 4．56±0．21 1．50±0．15 6．56±0．25治療后 6（60．35）＃ 0．67±0．09▲＃ 2．29±0．20 4．54±0．17 1．49±0．17 5．02±0．33▲＃冬蟲夏草組 治療前 1．59±0．12 2．54±0．13 4．53±0．14 1．51±0．12 6．07±0．31治療后 4（40．87）＃☆ 0．68±0．09▲☆ 2．65±0．07 4．55±0．24 1．47±0．16 4．92±0．27▲☆

2.2 冬蟲夏草浸出液對肝移植大鼠免疫系統的影響見表2。

表2 冬蟲夏草浸出液對肝移植大鼠免疫系統的影響（±s，n＝10）

表2 冬蟲夏草浸出液對肝移植大鼠免疫系統的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較 ，＃P＜0．05；與空白對照組比較 ，△P＜0．05；與治療前比較，▲P＜0．05；與硫唑嘌呤組比較 ，☆P＜0．05

治療后紅細胞／（個／μL） 8．56±0．65 8．61±0．73 8．28±0．74 7．83±0．85△▲ 8．97±0．83 6．59±0．54▲＃ 8．39±0．23 6．71±0．870▲☆白細胞／（個／μL） 12．25±2．10 12．22±2．16 12．27±2．16 10．20±2．19△▲ 12．32±3．19 9．94±2．12▲＃ 12．15±0．24 10．36±0．090▲☆單核細胞／% 2．39±0．29 2．50±0．32 2．32±0．27 4．30±0．22△▲ 2．59±0．33 1．75±0．34▲＃ 2．39±0．29 1．86±0．370 T淋巴細胞／% 73．33±5．21 73．56±5．37 71．10±5．29 87．37±6．49△▲ 69．59±5．97 43．76±5．07▲＃ 47．27±4．26 47．79±5．350總蛋白／（g／100mL）15．60±2．36 17．52±2．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 8．74±1．18▲＃ 16．22±3．03 19．39±4．930▲☆白蛋白／（g／100mL）11．39±2．81 13．24±2．15 12．61±2．73 9．27±2．24△▲ 12．73±2．20 5．27±1．79▲＃ 11．50±2．50 14．27±4．450▲☆血紅蛋白／（g／100mL）14．60±7．36 15．52±6．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 7．74±1．18▲＃ 15．22±3．03 19．39±4．973項目 對照組治療前 治療后模型組治療前 治療后硫唑嘌呤組治療前 治療后冬蟲夏草組治療前▲☆

3 討論

冬蟲夏草（cordyceps sinensis，CS）是麥角菌科真菌寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲的子座及幼蟲尸體上長成的蟲草體與菌座復合體［7］，含有豐富的蟲草多糖、氨基酸、核苷、多種微量元素及甾醇類，味甘、性溫、歸腎、肺經，養肺陰、補腎陽、止咳化痰、抗癌防老。現代藥理研究［8］證實，其具有增強免疫力、抗腫瘤、降壓、抗炎、免疫調節、保護腎臟和肝臟等作用。《本草從新》言其有“保肺、止血、化痰、益腎”之功效，是我國傳統的滋補中藥［9］。近年來在創傷、大手術、器官移植時作為免疫調節劑而被廣泛應用［10］。其藥理作用主要是提高機體免疫力、調控腎臟固有細胞增殖及細胞外基質合成，調節細胞因子及生長因子及改善機體代謝機制，減少尿蛋白、改善腎功能及減輕腎臟病理改變等作用［11-12］。

在肝移植術后，由于手術創傷及異體排斥反應，需要大量應用免疫抑制藥及抗感染治療，而這類藥物均由細胞色素P450亞型酶代謝［13］。在本實驗研究中 ，筆者采用P450亞型酶活性及總蛋白、白蛋白、血紅蛋白、靜脈血紅細胞、白細胞、T-淋巴細胞及單核細胞數量，受體大鼠感染率等指標評定冬蟲夏草浸出液對大鼠肝移植術后免疫調節功能的影響。結果顯示，冬蟲夏草組大鼠在治療21 d后，CYPIA2及CYP3A4活性降低，這利于器官移植后抗排斥藥硫唑嘌呤的代謝，減輕其不良反應，增加療效。CYPIA2、CYP3A4酶主要在肝臟組織中表達，占肝臟P450蛋白含量的13%以上，與許多的藥物代謝及藥物的相互作用密切相關［12］。CYPIA2、CYP3A4酶的活性升高代表所使用的藥物臨床不良反應增加，療效降低，故在臨床使用時應盡量避免與經P450亞型酶代謝的藥物聯合應用，以免影響療效。本實驗研究證實冬蟲夏草組具有降低P450亞型酶，減少不良反應的作用。靜脈血紅、白細胞，T-淋巴細胞及單核細胞數量明顯降低，說明其不影響免疫抑制劑硫唑嘌呤抑制T-淋巴細胞的生成，降低T-淋巴細胞的吞噬作用［14-16］。本研究認為 ，冬蟲夏草作為免疫調節劑，在不影響硫唑嘌呤抑制細胞免疫的同時，提高了機體的體液免疫功能，可使總蛋白、白蛋白及血紅蛋白、血清IgG升高，對機體免疫系統具有雙向調節作用，即在對實質器官進行選擇性免疫抑制的同時，不降低機體體液免疫系統的免疫防御作用，明顯降低了術后感染的發生率，是一種較理想的免疫調節劑。

［1］陸炯炯，杜雋銘，周學平，等．大鼠原位肝移植術后排斥反應病理動態變化［J］．上海交通大學學報（醫學版），2007，27（4）：475-477．

［2］LEE S，CHARTERS A C，CHANDLER J G，et al．A technique for orthotopic liver transplantation in the rat［J］．Transplantation，1973，16（6）：664-669．

［3］何勇 ，姜驪，魚達，等．大鼠50%減體積肝移植技術的改進［J］．中國比較醫學雜志 ，2013，23（11）：61-63．

［4］張建紅，劉田福，武冬梅，等．生物醫學研究中的實驗動物福利問題［J］．中國實驗動物學雜志，2001，11（1）：62-64．

［5］黃長勝．冬蟲夏草提取加工方法大全［M］．天津：天津科學技術出版社，2014：147-149．

［6］劉艷，王海霞，黃麗軍，等．大鼠肝微粒體法測定3種中藥對CYP3A4亞型的作用［J］．醫藥導報，2011，30（3）：285-289．

［7］胡楊青，周巧玲，劉抗寒 ，等 ．冬蟲夏草對糖尿病腎病鼠腎組織轉化生長因子β／C-myc表達的影響［J］．腎臟病與透析腎移植雜志2005，14（5）：413-417．

［8］張偉 ，夏曉紅，王燕凌，等．老年大鼠腎缺血再灌注后肺損傷一氧化氮合酶的變化與意義［J］．陜西醫學雜志，2010，39（4）：411-413．

［9］唐瑭，陳德森，郭俐宏 ．冬蟲夏草對糖尿病模型大鼠腎臟的保護作用［J］．國際中醫中藥雜志 ，2013，35（6）：510-512．

［10］PALEVSKY P M，ZHANG J-h．O'connor TZ，et al．intensity of renal support in itically ill patients with acute kidney injury［J］．New England Journal of Medicine，2008，359（6）：7-9．

［11］丁晨光，田普訓，靳占奎 ，等 ．冬蟲夏草制劑在腎移植受者中的臨床應用和機制探討［J］．中國中西醫結合雜志，2009，29（11）：975-978．

［12］李英，陳德森，李莉．阿拓莫蘭聯合百令膠囊治療糖尿病腎病合并高血壓的臨床研究［J］．世界中醫藥 ，2014，9（3）：311-312．

［13］李菲，程澤能．與細胞色素P4501A2相關的藥物相互作用［J］．中國藥房，2002，13（9）：568-569．

［14］李端．影響免疫功能的藥物［M］．北京：人民衛生出版社，2007：574-580．

［15］宮念樵，葉啟發，姜漢英 ，等 ．藥物預處理和缺血預處理對供肝保護作用的比較研究［J］．中華肝膽外科雜志，2000，6（4）：282-284．

［16］宋艷麗，郭俐宏，朱克剛．百令膠囊對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用［J］．陜西醫學雜志，2014，43（1）：25-26．

Cordyceps sinensis from leaching solution of azathioprine on regulating immune response after liver transplantation in rats

ZOU Peixia1，LI Min1，LI Li2，WANG Wenjie1，CHEN Desen2*

（1．Pediatric Department，Shiyan Taihe Hospital，Shiyan 442000，Hubei Province，China；2．Hubei Medical College，Shiyan 442000，Hubei Province，China）

Objective To observe the effects of cordyceps sinensis extract combined with azathioprine on rat reduced size liver 1／2 immune function after transplantation．Methods 80 rats are randomly divided into blank control group，model group，azathioprine，cordyceps sinensis group，1／2 of rat orthotopic liver transplantation with reduced size modified cuff technique，postoperative azathioprine azathioprine dilute solution by gavage 1．0 mg／（kg?d），Cordyceps sinensis extract group 6% （10 mL／kg）＋oral azathioprine 1．0 mg／（kg?d）by gavage．In 21 days of treatment（d），the determination of hepatic microsomal cytochrome P450isoforms（CYPIA2，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4）activity，serum total protein，albumin，hemoglobin，red blood cells，white blood cells，T lymphocytes，the number of mononuclear cells，receptor of rat infection rate．Results Cordyceps sinensis extract significantly inhibites the survival rate of the recipient rat P450isoforms of CYPIA2（0．68±0．09），the enzyme activity of CYP3A4（4．92±0．27），lower vein red blood cells（6．71±0．87），the number of white blood cells（10．36±0．09），increased serum total protein，albumin（19．39±4．93）（14．27±4．45）and hemoglobincontent（19．39±4．973）is significantly lower in rats，the infection rate of 40．87% ．Compared with azathioprine（P＜0．05），the differences are statistically significant．There is no significant effect on the number of T lymphocytes and mononuclear cells，compared with azathioprine group，P＞0．05．Conclusion Cordyceps sinensis extract on azathioprine suppresses hepatic allograft rejection and at the same time，improve hypoproteinemia after liver transplantation，enhance humoral immunity，and has no significant effect on the cellular immune function，it has a dual immunomodulatory activity．

rats；cordyceps sinensis extract；azathioprine；liver transplantation；immune regulation大鼠同種異體1／2減體積原位肝臟移植為成熟的肝移植方法之一［1］，由Lee于1973年報道［2］，該動物模型可真實的反應肝移植術后機能排斥反應，為臨床治療提供可靠的實驗數據。在本實驗中，筆者采用改良雙袖套法進行大鼠同種異體1／2減體積原位肝臟移植，系統觀察了冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對肝移植術后大鼠免疫調節功能的影響，為其臨床肝臟移植的治療提供實驗基礎及理論依據。

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0901-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．007

2015-02-10）

鄒佩霞（1962-），女，主管護師，主要從事臨床藥理學與護理學研究。

*通信作者：陳德森，電話-18972486567，電子信箱-cdscds1226＠126.com