逍遙散對抑郁模型大鼠海馬中樞神經遞質含量及BDNF和TrkB表達的影響

韓海洋，彭淑芹，徐向東*

（1．山東省中醫院，濟南250011；2．山東中醫藥大學藥學院，濟南250355）

逍遙散對抑郁模型大鼠海馬中樞神經遞質含量及BDNF和TrkB表達的影響

韓海洋1，彭淑芹2，徐向東1*

（1．山東省中醫院，濟南250011；2．山東中醫藥大學藥學院，濟南250355）

目的 探討逍遙散對抑郁模型大鼠海馬中神經遞質（5-HT、NE、DA）的含量及海馬腦源性神經營養因子（BDNF）和其受體型酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）表達的影響，揭示逍遙散抗抑郁的機制。方法 將SD雄性大鼠50只隨機分為正常組，模型組，鹽酸氟西汀組（3 mg／kg），逍遙散高、低劑量組（14、7 g／kg）。除正常組外，對其余各組大鼠進行56 d的孤養加慢性應激刺激，第29天起灌胃給藥，連續給藥28 d，給藥結束后解剖大鼠取海馬。采用放免法測定大鼠海馬中神經遞質5-HT、DA、NE的含量變化；采用免疫組化法檢測海馬中BDNF和TrkB陽性神經元面密度值的變化。結果 與正常組相比，模型組大鼠海馬中5-HT、DA、NE的含量顯著下降，BDNF和TrkB陽性神經元面密度值顯著減小（P＜0.01），與模型組相比，逍遙散高、低劑量可以顯著增加海馬中5-HT、DA、NE的含量，明顯提高BDNF和TrkB陽性神經元面密度值（P＜0.05或 P＜0.01）。結論 逍遙散可明顯改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態，其機制與其可增加相關神經遞質的含量，增強BDNF和TrkB表達有關。

逍遙散；神經遞質；海馬；腦源性神經營養因子；酪氨酸蛋白激酶B

抑郁癥是一種情感障礙性精神疾病，主要表現為情感低落、思維遲緩，以及言語動作減少、遲緩等，危害性極大。抑郁癥發病率高居各類精神疾病的首位，全世界平均每年有11.3%的成年人患上抑郁癥。據WHO和美國哈佛大學公共衛生學院預測：到2020年，抑郁癥將成為導致人類死亡和殘疾的第二大疾病［1］。抑郁癥屬中醫“郁證”范疇。中醫認為抑郁癥與機體情志不暢，氣機紊亂，肝、心、脾3個臟器的功能失調等有關［2］。逍遙散具有疏肝解郁的功效，是中醫臨床上調治情志活動的經典名方。本實驗利用孤養加慢性應激的方法制造大鼠肝郁氣滯型抑郁模型，通過檢測海馬和下丘腦中神經遞質（5-HT、NE和DA）的含量變化、海馬腦源性神經元（BDNF）和受體型酪氨酸蛋白激酶（TrKB）的表達來探討逍遙散治療抑郁癥的主要作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級成年Wistar雄性大鼠，共90只，體質量（180±20）g，購于山東魯抗動物實驗中心，合格證號：SCXK魯20130001。購買后在實驗室動物房適應性飼養7 d，室溫（24±1）℃。除特別說明外，所有大鼠均為自由飲水和攝食，人工明／暗為12 h／12 h晝夜節律（光照時間為9：00—21：00）。

1.2 儀器 0507008型電子稱，TC-512型切片機，

DT5-3型低速自動平衡離心機，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機，101-E型電熱鼓風干燥箱，SHA-B水浴恒溫振蕩器，CM1850型冰凍切片機，RF-540熒光分光光度計。

1.3 藥物與試劑

1.3.1 逍遙散 逍遙散由柴胡15 g，當歸15 g，白芍15 g，白術15 g，茯苓15 g，生姜15 g，薄荷6 g，炙甘草6 g，燒生姜1塊組成。以上藥材購于山東省中醫院，經孫萍主任藥師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》（2010版一部）該藥材項下相關規定。取逍遙散510 g，加8倍量的水侵泡1 h后煎煮，沸騰后文火煎30 min，過濾；第2次加5倍量的水煎煮，水沸后用文火煎30 min，過濾，合并2次濾液，常壓濃縮至濃度為1.0 g／mL。鹽酸氟西汀膠囊由禮來蘇州制藥有限公司生產，生產批號2061A，分包裝批號2061AA，進口藥品注冊證號H20070375，國藥準字J20080016。

1.3.2 試劑 MK1250型ChAT原位雜交試劑盒（武漢博士德生物有限公司），BA0881型BDNF抗體（武漢博士德生物有限公司），BA1454型TrkB抗體（SANTA CRVZ biotechnology），BA1054型生物素化羊抗兔G（武漢博士德生物有限公司，Sigma分裝），SABC試劑盒（美國VECTOR公司，批號SA0011），KT011型DAB顯色劑（武漢博士德生物有限公司），BSA（Sigma公司，批號80034）。

2 方法

2.1 分組 對50只大鼠稱重，編號，通過隨機數字表采用隨機區組方法分組，確保實驗前各組大鼠體質量均衡。將50只大鼠共分為5組：正常組，模型組，鹽酸氟西汀組，逍遙散低、高劑量組，各10只，孤養。2.2 造模 在造模的56 d里，除正常組外，其他各組分別接受7種不同的刺激，分別是24 h禁食，24 h禁水，4℃冷水游泳，50℃熱刺激5 min，夾尾2 min，高速水平震蕩40 min，電擊足底。第29天起各組灌胃給藥，連續給藥28 d。

2.3 取材 實驗第56天對各組大鼠進行處理，用3%戊巴比妥鈉溶液將大鼠完全麻醉后固定在手術板上開胸暴露心臟，用眼科剪剪開右心耳，將透皮針頭經心眼插入左心室，快速用生理鹽水灌流沖洗，再用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖固定液（PB，pH 7.4）灌流固定，取出下丘腦和海馬后放入EP管中，再將其放入-80℃冰箱中冷凍保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 神經遞質的檢測 將-80℃冰凍的海馬組織研碎，勻漿液經漩渦振蕩5 min后，在3 000 r／min離心5 min（-4℃），取出上清液2.0 mL分別加正庚烷4.0 mL，0.1 mol／L HCl 2.0 mL，漩渦振蕩5 min后，在3 000 r／min下離心5 min。水相部分留作測定5-HT、NE、DA。用熒光分光光度法測定海馬組織中5-HT、NE、DA的含量［3-5］，測定下丘腦神經遞質5-HT、DA和NE含量的方法同上。

2.4.2 BDNF及TrKB陽性神經元面密度值的檢測將海馬置于4%多聚甲醛中固定48 h，之后轉移到20%蔗糖溶液中4℃沉底后再轉移到30%蔗糖溶液中，沉底后用恒溫冷凍切片機連續冠狀切片，片厚約25 μm。采用免疫組織化學法檢測。每只大鼠組織隨機選取5張切片，嚴格按照武漢博士德生物工程有限公司提供的試劑盒說明書進行操作。在10×40倍光學顯微鏡下觀察所有標本，在10×10方格參照體積內計數陽性染色細胞截面與方格橫線的交點數，各切片海馬CA3區和DG區隨機計數5個視野，取其平均值，然后依據截點／總線長法，計算各切片海馬CA3區和DG區陽性染色神經元面密度值［6］。

3 結果

3.1 大鼠海馬中5-HT、NE、DA的含量變化 見表1。

表1 各組大鼠海馬神經遞質5-HT、NE、DA含量變化（±s，n＝10） ng／g

表1 各組大鼠海馬神經遞質5-HT、NE、DA含量變化（±s，n＝10） ng／g

注：與正常組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

DA正常組 — 11．77±1．69 32．16±3．04 5．33±0．48模型組 — 7．36±0．87＃＃ 14．84±2．49＃＃ 2．13±0．45＃＃鹽酸氟西汀組 3×10-3 11．13±1．48△△ 31．45±1．19△△ 4．77±0．31＃△△逍遙散低劑量組 7.3 8．20±1．25＃＃ 19．62±1．18＃＃△△ 2．72±0．20＃△逍遙散高劑量組 29.2 10．30±1．00＃＃△△ 30．17±1．73＃△△ 4．38±0．54組 別 劑量／（g／kg） 5-HT NE＃＃△△

3.2 大鼠下丘腦中5-HT、NE、DA的含量變化 見表2。

表2 各組大鼠下丘腦神經遞質5-HT、NE、DA含量變化（±s，n＝10） ng／g

表2 各組大鼠下丘腦神經遞質5-HT、NE、DA含量變化（±s，n＝10） ng／g

注：與正常組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

DA正常組 — 38．19±1．40 52．53±3．01 7．72±0．35模型組 — 15．94±1．26＃＃ 29．00±3．01＃＃ 4．95±0．65＃＃鹽酸氟西汀組 3×10-3 34．32±3．07＃＃△△ 50．48±5．60△△ 7．09±0．57＃△△逍遙散低劑量組 7.3 19．21±2．61＃＃△△ 33．18±2．73＃＃△ 5．57±0．69＃＃△逍遙散高劑量組 29.2 33．06±1．61＃＃△△ 47．13±3．04＃＃△△ 6．71±0．73組 別 劑量／（g／kg） 5-HT NE＃＃△△

3.3 大鼠海馬BDNF、TrkB陽性神經元面密度值的變化 見表3。

表3 各組大鼠海馬BDNF、TrkB陽性神經元面密度值的變化（±s，n＝10）

表3 各組大鼠海馬BDNF、TrkB陽性神經元面密度值的變化（±s，n＝10）

注：與正常組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 劑量／（g／kg）BDNF 神經元面密度值CA3區 DG區神經元面密度值CA3區 DG區TrkB正常組 — 0．61±0．08 0．46±0．04 0．57±0．05 0．49±0．09模型組 — 0．19±0．05＃＃ 0．21±0．06＃＃ 0．20±0．09＃＃ 0．19±0．03＃＃鹽酸氟西汀組 3×10-3 0．54±0．12△△ 0．41±0．08△△ 0．55±0．07△△ 0．44±0．07＃△△逍遙散低劑量組 7.3 0．30±0．11＃＃△ 0．20±0．07＃＃ 0．34±0．04＃＃△△ 0．29±0．06＃＃△△逍遙散高劑量組 29.2 0．57±0．13△△ 0．38±0．05＃△△ 0．54±0．09△△ 0．43±0．06＃△△

4 討論

BDNF屬于神經營養素家族中重要的一員，對發育過程中神經元的存活、分化、生長以及成年神經細胞的存活和功能起到重要作用。近年來研究［7-11］表明，神經營養因子尤其是BDNF在抑郁癥發病和治療中起了重要作用，其作用主要體現在對各種神經元尤其是5-HT和DA能神經元的發育分化與生長再生具有維持和促進作用，如果神經營養不足可引起腦區功能受損，因此抗抑郁治療可以上調BDNF并翻轉這種損害。有研究［12-13］表明：BDNF的下調可增加海馬神經元對傷害性應激的敏感性，間接引起神經毒性，從而導致海馬神經元萎縮甚至死亡。動物實驗［14］證實，外源性BDNF對5-HT能等神經元具有營養再生作用 ，而且具有抗抑郁的作用。另有研究［15］顯示：神經營養因子可能與DA、膽堿脂能、5-羥色胺能、腎上腺素能神經元的可塑性有密切關系，并可能參與多種神經遞質的傳遞。研究［16］發現，酪氨酸蛋白激酶B（TrKB）是BDNF高親和力受體，TrKB在神經元的生存、分化和生長、維持神經元功能和再生修復等多方面發揮重要作用。只有當BDNF與TrKB結合后才可以啟動細胞內信號轉導途徑，從而產生相應的分子保護神經元并促進再生作用［17］。BDNF可通過靶源性，自分泌和旁分泌方式與神經細胞上高親和力的酪氨酸蛋白激酶B（TrKB）受體結合，激發各種信號傳導通路而發揮其特殊的生物作用［18］。實驗結果表明，模型組大鼠海馬中TrKB表達明顯較少，鹽酸氟西汀組和逍遙散高劑量組可見大量陽性神經元顆粒，逍遙散低劑量組中陽性神經元顆粒較少。由此說明，逍遙散能通過提高大鼠海馬BDNF及TrKB的表達而達到改善大鼠抑郁癥狀；同鹽酸氟西汀一樣具有明顯的抗抑郁作用。

逍遙散由柴胡、芍藥、白術、當歸、茯苓、甘草、燒生姜和薄荷組成。現代研究證明，柴胡的主要成分是柴胡皂苷，具有鎮靜、抗驚厥、止痛的作用，柴胡醇提物也能提高中樞神經興奮性；芍藥總皂苷具有抗炎、鎮痛、鎮靜的作用，能顯著改善不同功能狀態下的大鼠睡眠；芍藥苷對海馬神經元的存活和生長有促進作用；白術對植物神經系統有雙向調節作用，白術多糖能提高小鼠學習記憶和抗氧化作用；茯苓和甘草具有鎮靜作用，生姜精油可以顯著抑制小鼠自發活動，具有顯著的抗驚厥和鎮痛作用，薄荷油也能興奮中樞神經。這些均能顯示逍遙散中各藥對中樞神經系統有不同的調節作用，說明逍遙散對中樞神經系統具有多靶點、多環節的雙向調節作用。

本實驗表明逍遙散能夠促進神經遞質5-HT、NE和DA的分泌，上調海馬BDNF、TrKB的表達水平，這可能是其抗抑郁作用的機制。

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Xiaoyaosan on content of nurotransmitter of depression model SD rats'hippocampus and on brain-derived neurotrophic factor and expression of receptor TrkB of its Hippocampus

HAN Haiyang1，PENG Shuqin2，XU Xiangdong1*
（1．Shandong Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital，Jinan 250011，China；2．Shangdong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

Objective To study the effect of Xiaoyaosan on the cotent of nurotransmitter of depression model SD Rats hippocampus，and on brain-derived neurotrophic factor and the expression of receptor TrkB of its hippocampus，to reveal the mechanism of antidepressant of Xiaoyaosan．Methods We equally assign 50 male rats into a normal，a model，a Fluoxetine（3 mg?kg），and a high or low of Xiaoyaosan group（14．7 g?kg）．Except the normal group，we conducted 56-day separation and chronic stress stimulation on the remaining rats．From the twenty-ninth day，we will dose the rats by ig，continuous administration for 28 days．After the end of dosing，anatomize the rats to get their hippocampus．Determinate the changes of 5-HT，DA，NE contenting in neurotransmitter of the rats hippocampus by radioimmune assay．Test the changes of BDNF and TrkB's Positive neurons surface density values by immunohistochemistry．Results Compared with the normal group，the content of 5-HT，DA，NE in hippocampus of model group rats decreased significantly，and so do BDNF and TrkB positive

Xiaoyaosan；neurotransmitter；hippocampi；BDNF；TrkB

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0893-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．005

2015-03-11）

山東省2011-2012年度中醫藥科技發展計劃項目（2011-75）。

韓海洋（1971-），男，大學本科，主管藥師，主要從事中藥新藥開發及中藥炮制原理的研究。

*通信作者：徐向東，男，碩士，副主任藥師，電話-13793188391，電子信箱-zhengsanxiasd＠126．com

neurons surface density values（P＜0．01）．Compared with the model group，high or low dosage of Xiaoyaosan can be significantly increased the content of 5-HT，DA，NE in the hippocampus and BDNF and TrkB positive neurons surface density values（P＜0．05 or P＜0．01）．Conclusion Xiaoyaosan can significantly improve the depressive state of depression model rats．Its mechanism is associated with the increasing content of related neurotransmitters and the enhancing BDNF and TrkB expression．