海產品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的應用

梁華麗

（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾516600）

·應用研究·

海產品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的應用

梁華麗*

（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾516600）

通常弧菌類的細菌不但能夠在動物中傳播，而且還能夠傳染給人類。病原性的弧菌則是在海水養殖類動物體內很常見的細菌性病原體，它的流行速度非常快，傷害也非常大，嚴重影響了包括海水魚、貝殼類生物養殖業的正常運轉。霍亂弧菌擁有高度的致病性，海產品如果被霍亂弧菌感染，細菌就可能會在其體內長時間留存，還會隨著生物的活動污染水資源，最后還會通過寄生體傳染給人類，形成非常嚴重的疾病泛濫，歷史上曾經有過多次關于霍亂災難的記載。由此，在對海水產品進行養殖的過程中，絕對不能放松對霍亂弧菌進行檢測和控制的力度，必須建立起具有高度時效性以及高度敏感性的檢測判斷方法，借此大大減少檢測時間，進而盡可能降低其對養殖業的傷害以及對人們身體健康乃至于生命的威脅。

1 霍亂弧菌以及當前檢測情況概述

霍亂弧菌是造成霍亂在人類群體中大面積傳播的罪魁禍首，在歷史記載當中，霍亂是大量非常古老并且流行起來范圍很廣、傷害性很高的烈性傳染病之一，曾經是一種“不治之癥”，引起過多次大面積騷亂，其主要病癥表現為嘔吐以及腹瀉，最終脫水致死，死亡率極高，國際檢疫部門將其認為是一種嚴重的傳染疾病。霍亂弧菌屬于革蘭氏陰性細菌，在菌體表面存在單鞭毛以及菌毛，有一部分存在莢膜，大量的細菌群當中，01細菌群以及0139細菌群有高度致病性，一旦擴散就很可能會造成嚴重的霍亂。

通常人類感染霍亂弧菌的途徑是被感染的水下生物傳染造成的飲水傳染。或者是通過食物直接入口感染。在條件滿足的情況下，霍亂弧菌會迅速進入生物體的小腸部分，并且能夠依靠其鞭毛自主運動，可以靈活地越過機體黏膜表面自帶的粘液層，同時還可能會借助菌毛運動與腸壁細胞相粘合，一旦尋找到適合其生存繁衍的“沃土”就會迅速繁殖，產生具有強烈毒性的腸毒素。霍亂弧菌的潛伏期極短，但是發病極快，患者往往措手不及。在發病后，患者會出現上吐下瀉的癥狀，這也是這種疾病典型的特點。可以肯定的是，無論哪種傳播途徑，霍亂弧菌的傳播都和海產品或者淡水產品的感染有關，因此對海產品以及淡水產品進行霍亂弧菌的檢測是非常重要的。

對于傳統的檢測霍亂弧菌的方法，存在操作繁瑣的弊端，且檢測需要的周期非常長，不能同時進行大批量的樣品檢測。近幾年發展起來的檢測方法，如免疫學方法以及熒光定量法等檢測成本偏高，并不適合在基層檢測部門及單位進行推廣和使用。

環介導等溫擴增法（LAMP）是近幾年發展起來的一種新的檢測技術，這種方法可以在恒溫環境中很好地識別靶DNA中的特定區域，引物和DNA聚合酶擴增的核酸，并且擁有高度的靈敏性以及特殊性，實際操作起來也十分有效且便捷。在當前的科技環境下，這種技術逐漸開始在食源性致病菌的檢測中得到應用，不過對于霍亂弧菌實時濁度LAMP試驗所擁有的技術效果還沒有系統的研究分析報告。因此，本研究將對霍亂弧菌中的ctrA基因進行LAMP引物的設計，建立起適合霍亂弧菌檢測的LAMP檢測辦法，可以有效且迅速地降低對霍亂弧菌進行檢測所要花費的時間和精力，并且為未來控制或預防霍亂弧菌大面積傳染打下良好的理論基礎。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、非致病性霍亂弧菌分離菌株、擬態弧菌分離菌株、創傷弧菌，北京陸橋股份有限公司。

試劑：緩沖蛋白胨水、堿性蛋白胨水，北京陸橋技術責任有限公司；DNA抽取提取試劑盒、熒光定量測試試劑盒、霍亂弧菌致病性組DNA、擴增試劑盒、反應管，北京藍譜生物科技有限公司。

設備：實時濁度儀，日本榮研公司；分光光度計，日本島津公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 提取細菌基因組DNA

把供試驗的菌株放置在增菌培養基中進行培養，需要注意的是弧菌選擇堿性蛋白胨水來進行培養，其他的菌株則選擇緩沖蛋白胨水來進行培養，依照試劑盒提供的說明書來進行細菌基因組的提取，建立起供參考的菌株DNA模板庫，并且將其置于-20℃左右的環境中，隨時備用。

2.2.2 設計LAMP引物，計算長度

對比霍亂弧菌的基因序列，對于霍亂弧菌中包含的ctxA基因使用pr軟件進行引物設計，設計數量為3組，分別命名A、B、C組，并且由專門的單位完成合成的步驟，其具體長度情況見表1。

表1 霍亂弧菌中的ctxA基因擴增后LAMP引物的序列長度

2.2.3 篩選LAMP引物

對ctxA基因進行有針對性設計出的3組引物實時進行同步擴增，并且使用濁度儀來對其擴增效率進行檢測，并且在這之后有限選擇其中擴增效率最高并且沒有出現明顯的非特殊性擴增的一組。

2.2.4 擴增

實時擴增反應表現在濁度儀上，具體反應體系是25 μL，具體情況見表2。

表2 濁度儀中表現的實時擴增反應

除此之外，引物混合液在PM中的反應引物（反應條件：溫度65℃，反應時間：60 min）所具備的濃度情況見表3。

表3 引物混合液在PM中的反應引物所具備的濃度表

2.2.5 判別試驗結果

察濁儀器，濁度如果超過0.1，則認為是陽性。此處需要注意的是，將霍亂弧菌性基因組DNA認定為陽性組，同時將雙蒸水作為空白組進行對照，其他菌株作陰性對照組，同時開始LAMP擴增的操作。

2.2.6 擴增具備的靈敏性

通過分光光度計來對霍亂弧菌致病性基因組進行DNA含量的測定，原液稀釋，按照模板進行擴增操作，對其靈敏度進行總結記錄。

2.2.7 對海產品當中是否含有霍亂弧菌進行檢測

選取若干海產品，約100份，進行同樣的前處理后，進行預增菌，并進行細菌基因組DNA的提取，通過LAMP檢測方法以及采用SN/T 1022—2010進出口食品霍亂弧菌檢測進行對比操作，證實LAMP檢測法擁有可靠的實用性。

3 結果與分析

3.1 篩選引物試驗結果

將3組引物依照霍亂弧菌DNA作為基礎模板同時進行LAMP反應測試，并分別設置空白組進行對照，試驗擴增情況見圖1。由圖1可知，這3組引物都可以發生一定的反應，而空白組并沒有發生任何DNA擴增現象，其中A組引物組的擴增最快，同時也是出峰的時間最早一組。因此，選擇A組作為本次研究的最優組。

圖1 3組引物以及空白組引物擴增情況曲線圖

3.2 擴增靈敏性試驗結果

在基因組DNA含量測試結果中，霍亂弧菌致病組的DNA含量是8 ng/μL，稀釋之后進行了檢測，其結果如圖2所示。

圖2 靈敏性擴增情況曲線圖

在發生反應的60 min之內，6份樣品的濁度基本上都呈現出了陽性，同時，隨著模板不斷降低的濃度，反應的速率依然保持基本不變的狀態，反應的峰值出現的具體時間逐漸延遲，但是始終保持有效擴增，說明霍亂弧菌可以不斷地擴增稀釋。在此次反應當中，從產物的量來看，可以說明臨近值判定成陽性花費的時間只有4 min，證明這種方法對于基因擴增有很高的效率。

3.3 對海產品當中是否含有霍亂弧菌進行檢測的結果使用建立起的LAMP方法來對選取的100份海產品進行了檢測，其中有1份被檢測出霍亂弧菌呈現陽性（檢出概率為1%），這一結果和通過采用SN/T1022—2010標準方法的檢測結果保持一致，具體情況見表4。

表4 含有ctxA基因的海產品進行檢測后的結果對比

經過總結對比，說明LAMP檢測法是可靠的。

4 討論分析

經過本文的研究和分析，說明LAMP檢測法是可靠的。在當前的技術水平環境下，大部分建立起的LAMP檢測法只能使用在糖凝膠電泳當中進行結果判定，存在比較嚴重的安全隱患。同時，由于缺少對實時反應的監控能力，因此很難對假陽性以及非特殊反應的干擾因素進行準確的排除，導致檢測結果不準確。本文借助實時渾濁儀來具體分析LAMP反應的實際結果，能夠直觀地對反應進行觀察，并且可以借助設置分析排除一些曾經無法進行排除的干擾因素。

對引物進行合理的優化和適當的篩選能夠在短時間內進行準確的預測，本次研究借助LAMP研究技術對霍亂弧菌ctxA基因序列進行了一次完整的設計，并且得到了3組具有特殊性的引物，在LAMP擴增的結果當中明顯地顯示出來，這3組引物都能夠在ctxA基因的檢測當中進行使用，通過進一步的篩選之后，最終選擇了A組作為本次研究的最優組。

在本次LAMP高效率的反應中，對目的序列進行一定擴增，并且讓其達到了一定的臨界值之后，將會進入到一個高反應速率的階段當中，并且反應峰值也達到了一定高度，對模板進行稀釋只會對反應開始點的具體出現時間產生一定影響，并不會影響到整體反應的速度。在本次研究當中，稀釋到一定程度，花費了比較長的時間，這和反應起始的時候DNA的模板總量有所關聯，但是在擴增的產物量到達了臨界值之后，卻只花費了4min就達到了反應最高峰值，并且和其他的反應樣本達到的峰值基本一致，也說明這一方法具有極高的擴增速度。

在本次研究當中，建立起的霍亂弧菌濁度LAMP檢測法作用于全部的菌株之后，除了致病性霍亂弧菌之外，其他的菌株都呈現了明顯的陰性，說明使用的A組引物擁有針對霍亂弧菌高度的特異性以及敏感性。借助這一檢測方法，對選取的100份海產品進行了檢測，并且和采用SN/T 1022—2010中方法所檢測的結果進行了對比，得到了同樣的1%檢出概率，二者保持完全一致。但是根據研究前調查，傳統檢測辦法從對海產品的樣本收集開始算起，到最終得到完整準確的檢測結果都花費了5 d～10 d，甚至更久，但是檢測法卻僅僅花費了1 d時間，這對于需要高效率的檢測行業來說具有極大的優勢。

5 結語

研究結果表明，在對海水產品進行養殖的過程中，絕對不能放松對霍亂弧菌進行檢測和控制的力度，必須建立起具有高度時效性以及高度敏感性的檢測判斷方法，借此大大降低對該細菌檢測花費的時間，進而盡可能降低其對養殖業的傷害以及對人們的身體健康乃至于生命安全的威脅。LAMP檢測法不但操作簡便，結果也十分可靠，因此可以進行更廣泛地推廣和使用。

［1］胡興娟，沈飚，江玲麗，等.海產品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的建立［J］.河南農業科學，2014，43（10）：127-130.

［2］張曉君，白雪松，畢可然，等.泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）病原霍亂弧菌（Vibriocholerae）PCR與LAMP檢測方法的比較研究［J］.海洋與湖沼，2013，44（1）：213-218.

［3］薛超波，黃朱梁，孫瑛，等.海產品中創傷弧菌實時濁度LAMP檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2013，35（11）:53-56.

［4］黃朱梁，薛超波，孫瑛，等.食品中單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度（LAMP）檢測方法的建立［J］.食品工業，2015（1）：288-291.

［5］程晉霞，曾靜，張西萌，等.海產品中霍亂弧菌免疫磁分離和環介導等溫擴增快速檢測方法的建立［J］.中國食品學報，2015，15（2）：174-179.

［6］封立平，孔德英，孫濤，等.柑橘潰瘍病菌LAMP實時濁度檢測方法的建立及應用［J］.熱帶作物學報，2015，36（6）:1 153-1 160.

App lication of real-time turbidity LAMP test on vibrio cholera in seafood

LIANGHuali*
（Shanwei entry-exit inspection and quarantine bureau，Guangdong Shanwei 516600，China）

為了建立起一種同時具備快速、特殊、敏感以及有效的對霍亂弧菌進行檢測的辦法，并且借此來控制或預防該細菌造成大面積感染的可能性，對這種實際存在的霍亂弧菌中存在的ctxA基因所擁有的保守區域進行引物設計，通過實時濁度儀來進行LAMP檢測，即環介導等溫擴增研究法，對其所具備的特性以及敏感性進行研究分析，并且通過這一方法對極高可能存在海產品中的霍亂弧菌進行檢測。

海產品；霍亂弧菌；實時濁度；LAMP檢測

In order tocreate a rapid,specific,sensitive and effective detection ofvibriocholera,and thereby to control or prevent extensive infection caused by the bacteria,the conservative area of ctxA gene that exist in the vibrio cholerae have were primer designed,and LAMP detection was done by real-time turbidity instrument,named ring mediated isothermal amplification method.Its characteristics and sensitivity analysis were studied,and through the method the vibriocholera with high existence in seafood was detected.

seafood；vibrio cholerae；real-time turbidity；LAMP test

TS207.4

A

1673-6044（2015）04-0025-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.008

*梁華麗，女，1982年出生，2004年畢業于湛江海洋大學水產養殖專業，助理工程師。

2015-09-11