家蠅幼蟲抗菌物質提取方法的比較

雷 琎，張紫秋，王智柔，鄧先余，林連兵

(昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500)

家蠅是我國常見的一種資源性的昆蟲。研究發現，家蠅幼蟲體內含有多種抗菌物質，其中包括蛋白類，如:天蠶素、昆蟲防御素等(馬紅霞等，2007)，非蛋白類如:1-LPE (Meylaers et al.，2004)、幾丁質(Sukontascn et al.，2000)、尿囊素等(Moreira et al.，2003)。這些抗菌物質具有分子量小，熱穩定性好，廣譜抗菌 (翟朝陽，1996)甚至是抑制腫瘤細胞等特點 (Mohammad et al.，1995)。

利用基因工程克隆抗菌肽，其種類少，效果不佳且蠅蛆體內有非蛋白抗菌物質，這部分物質無法通過基因工程的方法合成，所以如何高效制備抗菌物質是工業上一直探索的問題。

目前國內關于家蠅抗菌物質的研究主要集中在抗菌肽的誘導與單蛋白的純化上，如周永富等(1997)探究了家蠅抗菌肽的誘導條件，陸婕等(2006)分離出單一的家蠅抗菌肽MD7095，陸婕等(2007)人采用加熱層析法和海藻酸法優化工業制備抗菌肽的方法，對于抗菌物質大量工業化制備的文獻較少見。

在陸婕等(2007)采用的海藻酸吸附和加熱后凍干再層析的制備方法中，由于海藻酸的昂貴和層析處理的樣品量少，在大規模制備上仍然存在一定的局限性。切向流是一種大體積的超濾系統，根據黨向利(2008)的研究結果表明，使用10 kDa的小體積超濾濃縮管就能很好的回收家蠅抗菌肽，基于此結論本文采用加熱后再利用切向流超濾法和直接凍干法提取抗菌物質，通過分析比較，探索最佳提取抗菌物質的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗蠅蛆:在65℃下干燥24 h的家蠅Musca domestica 幼蟲

測試菌株:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC6538、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC (B)63501、大腸桿菌 Escherichia coli 0157NOTC12900、大腸桿菌Escherichia coli Rosetta、沙門氏菌Salmonella enteritidis CMCC (B)50335、志賀氏菌Shigella dysenteriae A7CC10231 (以上菌種購自廣東微生物研究所)

主要試劑:GE Hiload Superdex 75 (GE Amersham)、LB 培養基(安琪)

主要儀器:層析系統AKTA Explorer (GE Amersham)、蛋白電泳系統(GE Amersham)、恒溫培養箱(上海一恒)、粉碎機(普潤)、真空冷凍干燥器(Jouan)、蠕動泵(Lopump)、10 kDa 切向流膜包(Sartorius)

1.2 方法

1.2.1 蠅蛆抗菌物質提取液制備

將400 g 干蠅蛆用粉碎機磨成粉末，將其溶于2 L 0.5 mol/L 乙酸溶液中，在4℃下靜置10 h，4℃8000 rpm 離心15 min，將上清通過1000 目的網目后置于100℃水浴鍋中水浴10 min，4℃8000 rpm 離心15 min，取上清，并用真空抽濾裝置透過0.22μm 濾膜，取濾液用于抗菌物質的濃縮。

1.2.2 抗菌物質的濃縮

本文采用兩種不同的方法濃縮抗菌物質，具體方法:(1)超濾法:采用切向流超濾法(如圖1的裝置)，將其中1 L 抗菌物質酸提取液在4℃通過10 kDa的切向流系統進行濃縮，至50 mL 獲得濃縮液。(2)直接凍干法:將抗菌物質提取液分裝于幾個平皿中進行真空冷凍干燥，將干燥后的粉末再次溶回50 mL 0.5 mol/L 乙酸溶液，以13000 rpm 離心去除沉淀，獲得可溶性的濃縮液，用于蛋白質含量測定。

圖1 切向流超濾裝置Fig.1 Device of tangential flow ultrafiltration

1.2.3 凝膠過濾層析

參照鐘雅(2007)的層析條件并適當改進，用0.2 mol/L 乙酸溶液平衡Superdex 75 柱子，分別將以上濃縮液以13000 rpm 離心后，通過0.22μm 針頭濾膜，取其中2 mL 進行凝膠過濾層析。以2.5 mL/min的速度用0.2 mol/L 乙酸進行洗脫，根據280 nm 處監測值對樣品分離的各組分進行收集，每管收集10 mL，并凍干后，每個組分加入1 mL 蒸餾水溶解，供抗菌活力檢測用。同時取10 mL 0.2 mol/L 醋酸凍干后溶于1 mL 蒸餾水中作為空白對照。切向流法制備層析的組分為A 組，直接凍干法制備的組分為B 組，空白組為C 組。

1.2.4 抗菌活力檢測

采用平板打孔法，取OD600 ≈0.8 待測菌500μL，加入到20 mL 預熱的LB 固體培養基中，混勻后倒平板。待瓊脂凝固后打孔，向孔內分別加入40μL 上述各組分的溶液，自然擴散30 min后，將平板倒置于37℃恒溫培養箱靜置過夜培養。

1.2.5 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法(Coligan，2003)，測定可溶性蛋白含量。

1.2.6 蛋白質電泳

采用Tricine-SDS-PAGE 法進行電泳，參考Herman 等(1987)的方法，分離膠濃度為17%，濃縮膠濃度為5%，每孔上樣20μL。

2 結果與分析

2.1 兩種濃縮方法制備液中蛋白含量測定結果

利用超濾法得到的抗菌物質為深褐色濃縮液，無沉淀;利用凍干法制備出的抗菌物質也為深褐色，但有較多沉淀。

通過考馬斯亮藍法測定超濾法制備液的可溶蛋白含量為10.2 mg/mL，而直接凍干法得到的可溶蛋白含量僅為1.2 mg/mL。

圖2 兩種不同濃縮液的凝膠層析結果Fig.2 Gel chromatography results of two different extraction methods

2.2 凝膠過濾層析結果

對采用超濾法獲得的濃縮液進行凝膠過濾層析后，收集得到25個組分(A1-A25)，直接凍干法獲得的濃縮液則得到15個組分(B1-B15)。

2.3 各組分抗菌活性的分布

采用7 種不同的測試菌對切向流超濾濃縮液和直接凍干濃縮液的不同組分抗菌能力進行檢測，結果如表1 和表2 所示。A1、A2、A10、A11、A12、A13、A20、A21 具有抗菌活性，但抗菌譜不盡相同。在這9個具有抗菌活性的組分中，A1、A2、A10、A11、A12、A13 抗菌譜均較窄，僅對革蘭氏陽性細菌和部分革蘭氏陰性細菌有抑菌能力，而A20、A21的抗菌譜較寬，對幾種測試菌都有不同程度的抑菌效果。但通過考馬斯亮藍法檢測，A1、A2、A10、A11、A12、A13 組分的蛋白量均超過0.5 mg/mL，而A20、A21 難以檢測的其含有蛋白，可能為非蛋白成分。

采用直接凍干法提取的蛋白再進行凝膠層析后，得到15個組分，除了B4 和B14 以外，所有組分均具有抗菌活性。其中B1、B2 僅對革蘭氏陽性細菌和部分革蘭氏陰性細菌有抑菌能力，兩個組分的蛋白量均超過0.2 mg/mL;B6-B12 具有較寬的廣譜抗菌能力，對7 種測試菌都有不同程度的抑菌效果，且有較強抗菌活性，其抑菌圈超過了1 cm，但無法通過考馬斯亮藍檢測到蛋白，也有可能是非蛋白成分。

空白對照組C 組對6 種測試菌均無抑菌效果。

表1 超濾法提取的抗菌物質各組分抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of antimicrobial substances components extracted by ultrafiltration method

表2 直接凍干法提取的抗菌物質各組分抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of antimicrobial substances components extracted by direct freeze-drying

2.4 活性組分的電泳結果

使用Tricine-SDS-PAGE 進行電泳，每孔上樣20μL，結果如圖3 所示(箭頭表示)。采用超濾法分離得到的各組分中，A2 分布在75 kDa、48 kDa、24 kDa、17 kDa 和11 kDa 幾個位置，A11主要集中在9 kDa-41 kDa，A12 主要集中在25 kDa-34 kDa 和7 kDa-18 kDa，A13 主要集中在25 kDa-33 kDa、15 kDa-17 kDa 和6 kDa-12 kDa 三段。A20 和A21 電泳后沒有顯示出明顯的條帶(圖中未顯示)，結合蛋白濃度測定的結果，斷定為非蛋白類物質。B1、B2 主要集中在15 kDa-17 kDa 和6 kDa-10 kDa 這兩段。B5-B11 電泳后沒有顯示出任何條帶(圖中未顯示)，結合蛋白濃度的測定結果，也推斷為非蛋白類物質。

A11 和A12的抗菌強度均好于A13、B1、B2，對比A11、A12、A13、B1、B2的電泳條帶可知有一部分的蛋白類的抗菌物質處在11 kDa-41 kDa這個范圍。A2 具有一定的抗菌活性，但是由于抗菌物質在制備過程中進行了沸水浴，所以電泳圖中的100 kDa、75 kDa、48 kDa 條帶的位置是少量未熱變性沉淀的蛋白，不具有抗菌活性，而24 kDa、17 kDa、11 kDa 條帶是具有抗菌活性的蛋白。

圖3 抗菌活性組分的電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of fractions with antibacterial activity

3 結論與討論

家蠅體內含有多種抗菌肽，這些抗菌肽對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有一定的殺滅作用。目前對抗菌肽的大規模制備仍處于探索階段。陸婕(2007)等人采用了海藻酸吸附的方法和加熱后直接凍干再層析的方法進行了提取，使用海藻酸吸附法并不能得到較高的產率且海藻酸較為昂貴，而使用加熱層析法雖然產率有所提升但是層析并不適合用于大規模的工業生產，故上述兩種方法并非工業化上最優方法。根據黨向利(2008)研究表明，使用10 kDa 超濾濃縮管進行超濾，抗菌肽的回收率可達到99%。由于濃縮管超濾的流速方向與濾膜是垂直的而切向流超濾的流速方向與濾膜是平行的，所以與濃縮管超濾相比切向流超濾不但可以更高的提高回收率而且可以一次性處理更大體積的樣品。本研究采用了加熱后通過10 kDa 切向流系統超濾和直接凍干兩種方法進行抗菌肽的提取，結果表明利用切向流超濾法得到的可溶蛋白量是直接凍干法可溶蛋白量的8.5 倍。考慮到切向流超濾是一種簡單的設備，使用時僅需要定期清洗即可重復使用，對于大規模工業生產這是一種簡單而且有效降低成本的方法。

在對比兩種制備方法制備的抗菌物質的組分分析方面，本研究采用凝膠過濾層析法，使用Superdex 75 凝膠過濾層析柱，參照鐘雅(2007)的層析條件并適當改變了流速，對使用兩種提取方法得到的抗菌肽進行分離得到了兩種不同的洗脫峰。使用超濾法提取的蛋白進行層析后在A280處得到多個吸收峰，其中收集到的蛋白組分的抗菌譜不如非蛋白組分的抗菌譜廣。使用直接凍干法提取的蛋白在A280處只有兩個峰，但抑菌試驗和蛋白含量檢測結果表明未能測出蛋白的組分無論從抗菌譜還是抗菌活性均更好。通過 Tricine SDS-PAGE后，通過分析對比，能測出蛋白類的抗菌物質的組分分布各不相同，但大致可以斷定抗菌物質是分布在11 kDa-41 kDa，而未能測出蛋白的組分均無法得到電泳圖，進一步證實這些組分為非蛋白類物質。

凝膠過濾層析過程中有大量無法用考馬斯亮藍法測出蛋白含量，但在A280有較高吸光值的物質，結合蛋白檢測結果斷定為非蛋白類的抗菌成分，家蠅體內除了抗菌肽以外也含有非蛋白類抗菌物質，如Meylaers 等(2004)用甲醇從家蠅體內提取出抗菌物質1-LPE，其分子量為451.2 Da，此外人們還發現了幾丁質、尿囊素等非蛋白類抗菌物質(Craezyk et al.，2001)。它們的分子量較小，具有抗細菌、真菌、病毒的作用，其中尿囊素還可以促進傷口的愈合(羅金香等，2005)。尿囊素在A293處有強烈的吸光度，殼聚糖的衍生物在A260處有最大吸光度，這些非蛋白抗菌組分也會在A280處會有一定的吸光度。

通過凝膠過濾層析分析顯示，在制備抗菌物質的方法上，使用切向流超濾法比直接凍干法得到的蛋白類抗菌組分多，非蛋白類抗菌組分少。通過蛋白電泳結果也顯示，使用10 kDa 切向流超濾可以高效回收復合抗菌物質中抗菌蛋白類成分。綜合上述結果可知，切向流超濾在有效濃縮蛋白類抗菌組分的同時，非蛋白類抗菌組分也從切向流超濾系統中透過。非蛋白類的抗菌物質可采用噴霧干燥等方法進行濃縮干燥。蛋白類抗菌組分與非蛋白類抗菌組分在此過程中得以分離，同時也保證了蛋白類的抗菌物質得到了最大程度的回收。

在家蠅的抗菌物質中，既有蛋白類抗菌物質也有非蛋白類抗菌物質，在制備蠅蛆抗菌物質時，需充分考慮不同方法獲得的組分差異和制備效率。

References)

Coligan JE.Short Protocols in Protein Science ［M］.Hoboken:John Wiley ＆ Sons，Inc.2003，41-60.

Craezyk TK，Knight R，Gilman RH，et al.The role of non-biting flies in the epidemiology of human infection diseaaes ［J］.Microbe and Infeclion，2001，3:231-235.

Dang XL.Preparation and Study on Separation and Purification of Musca domestica Pupa Natural Antibacterial Peptide ［D］.Guangzhou:Zhongshan Universiry，2008.［黨向利.家蠅蛹天然抗菌肽的制備及其分離純化研究［D］.廣州:中山大學，2008］

Hermann S，Von GJ.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD ［J］.Analytical Biochemistry，1987，166:368-379.

Lu J，Wang JH，Zhong Y，et al.Purification and characterization of weak-acid antibacterial peptide MD7095from Musca domestica larvae［J］.Acta Micrbidogica Sinica，2006，46 (3):406-411.［陸婕，汪俊漢，鐘雅，等.弱酸性家蠅蛆抗菌肽MD7095的分離純化及性質研究［J］.微生物學報，2006，46 (3):406-411］

Lu J，Zhong Y，Liu L，et al.Optimization of extraction technique for antibacterial peptides from Musca domestica larvae ［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50 (2):106-112.［陸婕，鐘雅，柳林，等.家蠅蛆抗菌肽提取工藝研究［J］.昆蟲學報，2007，50 (2):106-112］

Luo JX，Yang CL，Wu WD.Study and application of Musca domestic antimicrobial peptides ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2005，42 (3):235-239.［羅金香，楊春龍，吳偉東.家蠅抗菌肽的研究與應用［J］.應用昆蟲學報，2005，42 (3):235-239］

Ma HX，Sun N，Pei ZH，et al.Reseaech progress on antibiotic peptite of Musca domestica ［J］.Chinese Journal of Veterinary Drug，2007，41 (11):45-49.［馬紅霞，孫娜，裴志花，等.家蠅抗菌肽研究進展［J］.中國獸藥雜志，2007，41 (11):45-49］

Meylaers K，Clynen E，Daloze D.Identification of 1-lysophosphatidylethanolamine (C16 ∶1) as an antimicrobial compound in the housefly Musca domestica［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34 (1):43-49.

Sukontascn K，Bunchoo M，Khantawa B.Musca domestica as a mechanicak carrier of becteria in Chiang Mai，North Thailand ［J］.Vector Ecol.，2000，25:114-117.

Mohammad FV，Noorwala M，Ahmad VU，et al.A bidesmosidic triterpenoidal saponins from the roots of Symphytum off icinale ［J］.Planta Med.，1995，61:94.

Moreira CK，Capurro M，Calvo E.The Musca domestica larval hexamerin is composed of multiple，similar polypeptides ［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2003，33 (4):389-395.

Zhao CY.The progress of studies on insecet antibacterial proteins ［J］.Acta Entomologica Sinica，1996，39 (1):99-104.［翟朝陽.昆蟲抗菌物質的研究進展［J］.昆蟲學報，1996，39 (1):99-104］

Zhong Y.Purification and Partial Characterization of a Novel，Antibacterial Peptide from Musca domestica Larvae ［D］.Wuhan:Huazhong University of Science and Technology，2007.［鐘雅.一個新家蠅抗菌肽的分離純化和部分性質研究［D］.武漢:華中科技大學，2007］

Zhou YF，Rao JH，Yang JC，et al.Induction of antibacterial substance of Musca domestica ［J］.Journal of Biology，1997，14 (77):23-26.［周永富，饒軍華，陽建春，等.家蠅抗菌物質的誘導［J］.生物學雜志，1997，14 (77):23-26］