櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道好氧菌群分析及產纖維素酶菌的篩選

文 竹，姜義仁，黃 伶，王斌赫，鐘 亮，王 勇，秦 利

(沈陽農業大學生物科學技術學院，沈陽農業大學柞蠶研究所，遼寧省昆蟲資源工程技術研究中心，沈陽 110866)

昆蟲的腸道是從昆蟲發育開始就一直伴隨著昆蟲的生長、代謝等活動而結構復雜的環境，在昆蟲的腸道中寄生了大量的種類豐富的微生物，這些腸道內的微生物在昆蟲營養物質的吸收、利用和分解中起著非常重要作用(相輝和黃勇平，2008;黃云等，2009)。研究發現，一些以植物枝液作為食物來源的胸喙亞目Sternorrhyncha 昆蟲，與其體內的共生菌存在協作關系，體內共生菌可以消化分解植物木質部中的纖維素，使這一種類的昆蟲可以在營養條件缺乏和不均衡的條件下存活，為其生命活動提供能量(Baumann，2005)。另有研究表明，昆蟲腸道內共生菌可以提高宿主抵御外來天敵的作用，如Glaser 和Meola (2010)證明了黑腹果蠅Drosophila melanogaster 可以通過與體內沃爾巴克體Wolbachia的共生系統，抑制病毒傳播從而提高對節肢介體病毒侵染的抵抗能力。同時這一研究結果也暗示了沃爾巴克氏體可以提高致倦庫蚊Culex quinquefasciatus 抵抗RNA 病毒侵染的能力。

目前對于昆蟲腸道細菌多樣性研究主要來自于等翅目Isoptera，在鱗翅目Lepidoptera 和鞘翅目Coleoptera 昆蟲中也進行了一些研究調查。通過對不同種類昆蟲進行腸道微生物的研究發現，昆蟲腸道微生物的種類組成隨著昆蟲種類不同而不同。但已有昆蟲腸道微生物研究發現，變形菌門和厚壁菌門都是廣泛存在腸道中的常駐類群(夏曉峰等，2003;Shinzato et al.，2005;Anand et al.，2010)。研究者通過生理生化分離培養法和分子生物學相結合進行不同昆蟲的腸道菌群結構多樣性的研究，鑒定了多個細菌種類(袁志輝等，2006;相輝等，2007)，并證明了利用腸道微生物能提高家蠶Bombyx mori 等昆蟲的經濟生產價值(易平發等，2001)。纖維素是白蟻主要的生物能源物質，而其體內共生細菌在消化水解木質纖維素方面起到非常重要的作用，可以將纖維素水解成乙酸為白蟻提供能量 (曾文慧等，2010;韋戈等，2014)。家蠶以桑葉為食，桑葉中主要含有果膠、木聚糖、纖維素和淀粉四種多糖，Anand 等(2010)在家蠶腸道內共分離出11 種不同菌群，其中三種分離菌可以水解纖維素和木聚糖:氣單胞菌屬Aeromonas sp.可以利用羧甲基纖維素鈉和木聚糖;液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens 可以利用羧甲基纖維素、木聚糖和果膠;環狀芽孢桿菌Bacillus circulans 可以利用全部四種多糖。在柞蠶Antheraea pernyi的研究中，鄒昌瑞等(2011)發現，芽孢桿菌屬是柞蠶腸道內的產酶菌屬，可產纖維素酶和蛋白酶的腸道菌均為芽孢桿菌。

細菌的核糖體RNA (rRNA)編碼具有功能性和進化上的高度保守性。細菌16S 核糖體RNA(16S rRNA)的核苷酸序列分布在其周圍的1500個堿基左右的區域。細菌的16S rRNA 含有九個或更多的保守“通用”序列，每個保守區之間都具有物種的特異性序列，這些區域可以為后續進行的PCR 和分子雜交以及細菌鑒定提供基礎(張武先等，2011)。Giraffa 等(1998)使用核糖體DNA 擴增片段限制性內切酶分析 (amplified rDNA restriction analysis，ARDRA)方法鑒定了乳制品中含有的德氏乳桿菌Lactobacillus delbrueckii 及其三個亞種，使ARDRA 技術在實踐中用于確認DNA 數據庫中關于16S 序列的限制性圖譜得到驗證。16S rDNA PCR 擴增和ARDRA 技術被證明是用于識別菌株的一個可靠和快速的方法。由于ARDRA 是以核糖體DNA 序列的功能性和保守性為基礎進行的酶切分析，因此用于鑒定不同種類的結果也相對更為可靠，可以在16S rDNA 基因水平上對不同細菌進行區分(Mario et al.，1992)。

櫟黃掌舟蛾 Phalera assimilis 屬鱗翅目Lepidoptera 舟蛾科Notodontidae，此蟲主要寄生在柞樹和榆樹等經濟樹木上，以幼蟲取食樹葉為害(許青云和王衛紅，2011)，以8月孵化出的第二代幼蟲為害最為嚴重，是柞樹和柞蠶的重要害蟲之一，極端年份甚至可將柞葉取食殆盡，嚴重影響柞蠶繭產量(王傳海，2009)。本研究分離鑒定櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道好氧菌群，研究其腸道產酶菌能力，為研究櫟黃掌舟蛾幼蟲的取食特性及消化機理，發掘新的產酶菌資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 櫟黃掌舟蛾

供試櫟黃掌舟蛾幼蟲采集自沈陽農業大學東陵柞園。

1.1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(陳天壽，1995):牛肉粉3.6 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，加蒸餾水至1000 mL，pH7.2。

纖維素酶篩選培養基(頓寶慶等，2008;鄒昌瑞，2011):

(1)篩選培養基(羧甲基纖維素鈉CMC-Na 培養基):酵母浸粉1.0 g，NaCl 6 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO40.5 g，CaCl20.1 g，K2HPO42.0 g，羧甲基纖維素鈉15 g，(NH4)2SO42.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。

(2)種子培養基(纖維素酶提取培養基):蛋白胨10 g、酵母浸粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、CaCl21 g、FeSO41 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。

(3)發酵培養基:蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。

1.1.3 主要試劑

16S rDNA 引物購自上海生工生物工程有限公司，限制性內切酶Hae Ⅲ、Hind Ⅲ購自寶生物公司，10× M buffer 購自寶生物公司，DNS 試劑配制方法參照(唐冰等，2006)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離和純化

選取健康的櫟黃斑舟蛾3 齡幼蟲饑餓處理24 h，體表噴灑酒精進行體表消毒，放入75%酒精溶液中浸泡3 min 消毒并殺死，在滅菌水中清洗3 次，然后在蠟盤中無菌解剖，取出其腸道(嗉囊到直腸)放在無菌研缽中備用。

1.2.2 腸道菌分離培養

將取出的腸道每8 頭為1 組，加入1 mL 無菌水勻漿，勻漿后迅速2 倍、4 倍稀釋，每個稀釋度取50μL 用涂布法接種于NA 培養基上進行分離培養，每個稀釋度重復2 次。倒置培養48 ±2 h，挑取表征各異的菌落再進行分離、純化培養，分離的菌株斜面培養后在4℃下保存。

1.2.3 菌落形態及生理生化分析

從培養基分離得到菌落形態各異的腸道菌，對分離菌株進行生理生化檢測。檢測方法包括明膠液化、葡萄糖發酵、蔗糖利用等 (周德慶，1982;朱旭芬，2011)。

1.2.4 腸道分離細菌的16S rDNA 序列的PCR

使用菌落PCR的方法，采用細菌16S 通用引物對櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道細菌的16S rDNA 序列進行擴增，正向引物 (F:5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3');反向引 物 (R:5'-ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3')。PCR 反應體系為:細菌DNA 模板 (菌懸液)2μL，正反引物各2μL，10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL，Taq 酶0.5μL，補充H2O 至總體系50μL。

PCR 反應程序(袁秀潔，2010):94℃預變性3 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，34 次循環，72℃最終延伸5 min。

1.2.5 核糖體DNA 擴增片段限制性內切酶分析(ARDRA)

采用HaeⅢ、HindⅢ組合酶切核糖體DNA 擴增片段(孫佑赫和熊智，2012)，10μL 酶切體系(田方，2008):PCR 產物5μL，Hae Ⅲ、Hind Ⅲ各0.5μL，10×M buffer 1μL，補充水至10μL，37℃酶切4 h。

1.2.6 細菌16S rDNA 測序

挑選酶切結果不同的菌株送至上海生工生物工程有限公司進行測序，再與NCBI 數據庫進行基因BLAST 比對。

1.2.7 產纖維素酶菌株篩選及酶活測定

將菌種由培養斜面接種到含有30 mL 種子培養液的150 mL的三角瓶中，37℃、180 r/min 振蕩培養24 ±2 h，無菌吸取1 mL 種子液加入到50 mL發酵培養基中，200 r/min、37℃振蕩培養48 ±2 h，取出后5000 r/min 離心10 min，所得上清液為粗酶液并進行酶活力測定。

采用DNS 方法，將酶液用無菌水稀釋10 倍后取0.5 mL 酶液加入1.5 mL 濃度為0.625%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中，在50℃下水浴30 min，取出后加入2 mL 濃度為10%的NaOH 溶液終止反應，再加入3 mL 配制號的DNS 試劑(于沸水中煮15 min)，測定波長為520 nm 時的OD520值(Huang and Jiang，2002;吳琳等，2009)。

取配制好的濃度為10 mg/mL的標準葡萄糖溶液5 mL，用蒸餾水定容至50 mL，使終濃度為1 mg/mL，參照鄒昌瑞等(2011)配制成不同葡萄糖濃度的溶液，每個濃度取5 mL 混合液在沸水浴中煮沸5 min，用自來水流動沖洗冷卻后，加入10 mL 蒸餾水，震蕩混勻，在520 nm 波長處測定光密度。

將不同濃度葡萄糖溶液充分混勻后，使用紫外可見分光光度計選擇波長520 nm 處比色測定，用葡萄糖濃度為0的溶液調零，分別記錄光密度值。繪制出標準曲線，用于計算腸道菌株產纖維素酶的酶活力。

2 結果與分析

2.1 腸道細菌的分離及生理生化分析

櫟黃掌舟蛾幼蟲中腸腸道勻漿懸液經倍比稀釋涂布在基礎培養基培養后，根據菌落形態特征的不同分離得到23 株好氧細菌(編號1-23)，菌落顏色以白色、黃色為主，圓形或不規則圓形，多濕潤、不透明(表1)。

表1 菌落形態特征Table 1 Colony morphologies

對分離的各菌株進行革蘭氏染色、淀粉水解、脂肪水解、糖發酵、甲基紅等檢測，根據菌株的各項生理生化特性的相似性將供試菌株分成7 大類，第1 類包括1、3、4、15、17、20、21 號菌株，第2 類包括5、6、10、11、18、19 號菌株，第3 類包括13、14、16、22、23 號菌株，8 號和9號菌株完全相同，2 號、7 號、和12 號菌分別與其它菌株都有明顯差別(表2)。

表2 菌株的生理生化檢測結果Table 2 Physiological and biochemical tests of strains

(續上表)

2.2 細菌16S rDNA 序列PCR 擴增結果

以提取的細菌DNA為模板，采用通用引物對23 株細菌樣品的16S rDNA 進行PCR 擴增，得到重復性好、穩定清晰的特異擴增片段，長度約1500 bp (圖1)。

2.3 細菌16S rDNA的PCR 擴增片段ARDRA分析

供試細菌16S rDNA 經PCR 擴增后的片段采用Hae Ⅲ、Hind Ⅲ組合雙酶切(圖2)，根據酶切結果將供試菌株分為7 類，第1 類包括1、3、4、15、17、20、21 號菌株，第2 類包括2 和12 號菌株，第3 類包括13、14、16、22、23 號菌株，第4 類包括5、6、10 和18 號菌株;第5 類為7 號菌株，第6 類為8、9 和11 號菌株，第7 類為19號菌。

圖1 櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道細菌16S rDNA的PCR 產物Fig.1 16S rDNA PCR production of bacteria from larval Intestine of Phalera assimilis

圖2 櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道細菌16S rDNA的酶切分析Fig.2 16S rDNA digested analysis of bacteria from larval intestine of Phalera assimilis

2.4 細菌16S rDNA 序列分析

圖3 16S rDNA 序列的N-J 法分析Fig.3 Bacterial 16S rDNA sequences N-J method phylogenetic analysis system

根據上述酶切結果，篩選出不同類群的1、2、5、7、8、13、19 號共7個代表菌株進行測序，對測定的7個菌株的16S rDNA 序列提交在線NCBI工具進行BLAST 序列同源比對，并利用MEGA 5.05 軟件采用鄰接法(N-J)構建系統發育進化樹(圖3)，所得序列與數據庫中數據做比對分析，結果表明 1 號菌株與 Staphylococcus sciuri(KF876871.1)、Staphylococcus gallinarum (DQ350835.1)同源性為99%，屬于葡萄球菌屬Staphylococcus sp.;2 號菌株與Curtobacterium sp.(KJ184962.1)、Curtobacterium sp.(KJ184941.1)有99%同源性，屬于短小桿菌屬Curtobacterium sp.;5 號菌株與Lysinibacillus sp.(JN082733.1)、Lysinibacillus sphaericus (KF151164.1)有99%同源性，屬于賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus sp.;7 號菌株與Arthrobacter creatinolyticus (JX476083.1)、Arthrobacter sp.(FJ804474.1)有98%同源性，屬于阿特拉津降解菌屬Arthrobacter sp.;8 號菌株與Staphylococcus sciuri (KF876871.1)、Staphylococcus gallinarum (DQ350835.1)有99%同源性，屬于葡萄球菌屬 Staphylococcus sp.;13 號菌株與Curtobacterium sp.(DQ205304.1)、Curtobacterium sp.(AY688361.1)有99%同源性，屬于短小桿菌Curtobacterium sp.;19 號菌株與Enterococcus sp.(GU585584.1)、Enterococcus mundtii (JN995582.1)有99%同源性，屬于腸球菌Enterococcus sp.;結合酶切圖譜、形態特征及生理生化分析，本研究分離得到的1、3、4、8、9、11、15、17、20、21 號菌屬于葡萄球菌屬，2、12、13、14、16、22、23號菌屬于短小桿菌屬，5、6、10、18 號菌屬于賴氨酸芽孢桿菌屬，7 號屬于阿特拉津降解菌屬，19 號屬于腸球菌屬。表明篩選得到的以葡萄球菌屬和短小桿菌屬為主要的菌種類型。

2.5 產纖維素酶篩選及纖維素酶活力測定

根據不同的葡萄糖濃度的OD520繪制出標準曲線，見圖4。

通過篩選培養基篩選出產纖維素酶菌株6個，主要為芽孢桿菌屬和短小桿菌屬。其中10 號菌株的酶活力最高，13 號菌株的酶活力最低(表3)。

圖4 標準葡萄糖曲線Fig.4 The normative curved line of glucose

表3 纖維素酶活力測定(平均值±標準差)Table 3 Enzyme activity of Cellulase producing bacteria (Mean±SD)

3 結論與討論

鱗翅目昆蟲的腸道內環境pH 值為堿性(pH8-10)，使得嗜堿菌群更加適合繁殖和生存。葉絲纖維素轉化率很低(10%左右)一直是困擾蠶業及其制品的生產的問題，并因此導致經濟成本增加，生產效率不高。進行昆蟲腸道中的菌群結構、產酶菌及酶活力研究，對開發利用昆蟲微生物資源具有重要的意義 (Broderick et al.，2004;相輝等，2007)。90%甚至更多的自然微生物是無法通過人工培養分離純化的。單一依靠培養手段鑒定細菌不能全面反映真實結果(袁志輝等，2006)。

用ARDRA 多態性分析的方法和Hae Ⅲ、Hind Ⅲ組合雙酶切更加輕松便捷地對不同菌株進行類群劃分，簡化了傳統分類鑒定方法需要檢測不同生化指標的復雜步驟，節省了大量的培養時間(Vaneechoutte and Rudi，1992)。通過對23 株分離菌株進行16S rDNA 序列的PCR 擴增以及雙酶切圖譜可以看出，ARDRA 分析和Hae Ⅲ、Hind Ⅲ組合雙酶切可以反映出分離的腸道菌株的同源多樣性。

本研究在櫟黃掌舟蛾腸道中所分離得到的23個好氧菌株中，包括葡萄球菌屬9 株、短小桿菌屬7 株、賴氨酸芽孢桿菌屬4 株、腸球菌屬2 株和阿特拉津降解菌屬1 株，以葡萄球菌屬和短小桿菌屬居多。其中短小桿菌屬屬于變形菌門，賴氨酸芽孢桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬屬于厚壁菌門。可見在櫟黃掌舟蛾腸道內，厚壁菌門和變形菌門為優勢菌群。而我們采用相同方法從取食同一柞樹的柞蠶5 齡幼蟲腸道中分離出芽孢桿菌屬Bacillus、不動桿菌屬Acinetobacter 及腸桿菌屬Enterobacter，其中芽胞桿菌屬是柞蠶5 齡幼蟲腸道中的主要菌群(黃伶等，2014)，二者腸道微生物類群明顯不同。在安徽省合肥市飼養的柞蠶腸道微生物類群則多以芽孢桿菌、葡萄球菌和腸桿菌為主(鄒昌瑞等，2011)。同時，得到的阿特拉津降解菌與常規的腸道微生物類群有一定區別，常見的腸道菌群多為變形菌門和厚壁菌門，由于阿特拉津Atrazine 是一種廣泛且大量使用的農業除草劑，且遼河流域的地表水水體中阿特拉津含量非常高(嚴登華等，2005)，推測阿特拉津降解菌屬的出現可能是與此環境有關，應屬于過路菌，并非是幼蟲體內常駐菌群。對同為鱗翅目的另外4 種害蟲棉鈴蟲Helicoverpa armigera、菜青蟲Pieris rapae、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis 和甜菜夜蛾Spodoptera exergual的腸道微生物研究中發現(楊焊，2012)，四種昆蟲的腸道菌群結構非常相似，都含有克雷伯氏菌屬Klebsiella.sp、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae 和微球菌屬Micrococcus sp.，四種昆蟲都是以變形菌門和厚壁菌門為腸道優勢菌群，但同時也都含有各自所特有的菌群。本試驗從櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道分離的菌群同樣具有其獨特的結構組成，可能由于這些害蟲取食的植被不相同所造成。野生狀態下昆蟲所攝取的植物中會含有環境下的特定物質，會影響腸道菌群的組成，因此采集自不同地區的相同種類的昆蟲也會鑒定出不同種類的腸道菌群。有研究表明昆蟲取食的食物中若含有大量的丹寧，會改變一種水生昆蟲幼蟲的腸道內生菌結構 (Walenciak et al.，2002;相輝和黃勇平，2008)，柞樹葉中含有大量的單寧，不同種類單寧含量不同 (劉延蘭等，1984)，這可能是影響取食柞樹昆蟲的腸道微生物組成不同的因素之一。

葉絲纖維素轉化率很低(10%左右)一直是存在于蠶業及其制品生產過程中的問題，樹木的養殖成本又占有很大的比重，導致經濟效率不高。因此對家蠶、柞蠶和與它們爭食的鱗翅目昆蟲的腸道產纖維素菌群的研究十分必要。

由酶活力測定可以看出，與柞蠶腸道微生物相比，櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道產纖維素酶菌的酶活力不高，沒有柞蠶腸道產纖維素酶菌的分解能力強(鄒昌瑞，2011)。本實驗室采集相同環境生存的5 齡柞蠶幼蟲，篩選其腸道產纖維素酶菌株，其酶活力為85 U/mL，櫟黃掌舟蛾腸道產纖維素酶菌株比柞蠶腸道中的酶活力低(本實驗室研究結果待發表)，這可能與柞蠶經過長期馴化及向著高飼料效率方面選擇有關。

產纖維素酶的菌株能夠幫助植食性昆蟲的消化和吸收，有利于昆蟲的生長發育，但能否應用于經濟昆蟲的飼養與繁殖領域還有待于進一步研究。產纖維素酶菌不僅可以提高柞蠶等經濟昆蟲的經濟價值，還可提供新型微生物資源，應用于食品加工、造紙、醫療衛生和環境保護等領域，因此對纖維素酶和產酶菌的深入研究及應用具有非常廣闊的前景。

櫟黃掌舟蛾是柞園的主要害蟲，其幼蟲低齡期群居性取食和高齡期的食量暴增的為害對柞樹及柞蠶繭產量影響極大。本文試驗結果對櫟黃掌舟蛾幼蟲腸道微生物的初步研究對于今后鱗翅目昆蟲的取食和為害行為研究，研制新型微生物農藥制劑及開發微生物資源提供了理論基礎。

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