馬鈴薯4種病毒多重PCR檢測體系的建立

龐 博，劉秀麗，張金文，王 蒂，張俊蓮

(甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅農業大學農學院，蘭州 730070)

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實驗方法與技術
ExperimentalMethod&Technology

馬鈴薯4種病毒多重PCR檢測體系的建立

龐 博，劉秀麗，張金文*，王 蒂，張俊蓮

(甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅農業大學農學院，蘭州 730070)

我國馬鈴薯病毒主要有馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，常發生復合侵染。根據GenBank中4種馬鈴薯病毒的外殼蛋白(coat protein，CP)基因全長設計引物，通過RT-PCR擴增得到4種病毒CP基因全長片段，測序結果顯示序列同源性96%以上；針對4種病毒CP基因的保守序列分別設計引物，在一個PCR體系中同步對4種病毒進行擴增，得到421、202、516、330 bp的特異性條帶，優化建立了能同步檢測PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR檢測體系。檢測結果證明優化后的多重RT-PCR體系能在田間樣品中快速、高效地檢測出4種病毒。

分子檢測； 多重RT-PCR； 馬鈴薯病毒

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是甘肅省除小麥、玉米外的第三大糧食作物[1]。隨著產業發展和種植面積擴大，馬鈴薯病害逐年加重，特別是病毒病害，其導致品質和產量下降甚至引起品種退化[2]。已報道的馬鈴薯病毒、類病毒達40多種，其中危害嚴重的有馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒(PVM)及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)等，調查研究發現PVY、PVX、PVS及PLRV通常復合侵染馬鈴薯[3-5]使其危害加劇，需要可靠、方便、經濟的檢測方法。

馬鈴薯病毒檢測的分子生物學技術主要有：RT-PCR檢測技術[6-7]、指示分子NASBA檢測技術[8]和核酸雜交檢測技術[9]三大類，其中RT-PCR技術具有快速、靈敏度高、特異性強的特點，可進行大批量的樣本檢測，克服了指示植物法、血清學鑒定、電鏡法鑒定以及其他檢測方法中的一些缺點，比如檢測周期長、敏感度低、價格昂貴、技術條件要求高、工作量大[10]。常用的單重RT-PCR檢測，在1個反應管中只能擴增1種核酸片段，如要檢測復合侵染樣品中的幾種病毒時，則需進行多次RT-PCR反應，操作步驟繁瑣、易造成交叉污染，不能滿足現代檢測的需求。多重PCR是在同一反應體系中加入兩對以上特異性引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，多重PCR不僅有單重PCR的特異性和靈敏度[11-12]而且更具經濟性[13]。現在已廣泛應用于基因分型和植物病毒的檢測與鑒別。王鳳格等[14]利用多重PCR技術提高了玉米DNA指紋庫的構建效率，鄭軒等[15]應用多重PCR技術開展了對5種煙草病毒的檢測研究，范旭東等[16]建立了葡萄病毒病害的多重PCR同步檢測技術。本文針對馬鈴薯4種病毒建立了特異、高效的多重PCR檢測體系，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

2012年7月從甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所會川馬鈴薯育種實驗基地隨機采集可能被病毒感染，有明顯花葉、皺縮、矮化等癥狀的馬鈴薯葉片，按照疑似病毒種類分別裝在潔凈塑料袋中，保存于-70 ℃低溫冰箱。以實驗室保存的脫毒馬鈴薯試管苗作為陰性材料。

植物RNA提取試劑盒購自Omega公司, RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒購自Thermo公司，Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，TaqDNA聚合酶、pMD19-T vector、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、限制性內切酶等均購自TaKaRa(大連)寶生物有限公司，E.coliDH5α菌株為本實驗室保存。

1.2 引物合成

通過查詢GenBank中馬鈴薯4種病毒(PVX、PVY、PVS 和PLRV)CP基因序列，利用NCBI BLAST分別比對不同國家及地區已發表的PVX、PVY、PVS和PLRV的CP基因序列，尋找每種病毒各自的保守片段，利用Primer 6.0和多因素引物特異性評估系統MFEprimer 2.0[17-18]分析引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 多重PCR檢測擴增的病毒特異性引物序列

1.3 總RNA提取

采用Omega公司Plant RNA Kit試劑盒提取疑似帶毒馬鈴薯葉片和脫毒馬鈴薯葉片的總RNA作為待測的病毒RNA和陰性對照。提取步驟參照試劑盒說明書。

1.4 cDNA合成

反轉錄體系總體積20 μL，其中RNA 5 μL，Oligo(dT)18引物(100 μmol/L)1 μL[19]，隨機引物(100 μmol/L)1 μL，DEPC H2O 5 μL，先將這12 μL混合后在65 ℃放置5 min，然后冰上放置5 min，再加入5×反應緩沖液 4 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L each)2 μL，逆轉錄酶(200 U/μL)1 μL。在42 ℃反應60 min，70 ℃放置5 min，-20 ℃保存。

1.5 病毒CP全長基因擴增體系

PCR反應體系(25 μL)：17 μL dd H2O，2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)，2 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)和2 μL cDNA模板。PCR反應循環參數為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度分別為：PVYcp 52.3 ℃、PVScp 54 ℃、PVXcp 53.4 ℃、PLRVcp 52.2 ℃，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸10 min。取8 μL PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 PCR產物的克隆和測序

PVY、PVS、PVX和PLRV的CP基因全長片段用天根DNA純化提取試劑盒回收純化，然后與pMD19-T vector 4 ℃過夜連接，采用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態細胞，連接產物轉入E.coliDH5α感受態細胞，涂布于含Amp(100 mg/L)、X-Gal(20 g/L)和IPTG(50 g/L)的LB平板培養基上，37 ℃培養14～16 h，4 ℃放置2 h后進行藍白斑篩選。挑取陽性克隆提取質粒，放置-20 ℃保存，質粒經酶切和PCR驗證后送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。

1.7 多重PCR反應

將分別含有PVYcp、PVXcp、PVScp和PLRVcp全長序列的質粒混合，作為多重RT-PCR反應的模板，將各病毒特異性引物同時加入一個反應管作為混合引物(表1)。多重PCR反應體系(25 μL):19 μL ddH2O，2.5 μL 10 ×PCR buffer(Mg2+Plus)，0.5 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，0.5 μL上下游混合引物，0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，0.5 μL 二甲基亞砜(DMSO)和1.5 μL混合質粒模板。PCR反應循環參數:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次;最后72 ℃延伸15 min。取8 μL PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析比較。

1.8 MFEprimer 2.0的使用和多重PCR反應體系優化

使用在線MFEprimer 2.0評估引物和模板特異性結合能力[20]，對引物序列可能產生的非特異性擴增進行預測并虛擬出多重PCR電泳結果。多重PCR擴增效果的影響因素主要包括反應體系和反應條件二大類[21]，其中反應體系包括引物、緩沖液、模板和TaqDNA 聚合酶、dNTP、輔助劑等，反應條件包括退火溫度、循環數等。

1.9 田間樣品檢測

對田間樣品進行多重RT-PCR 檢測，驗證多重RT-PCR 檢測效果。

2 結果與分析

2.1 病毒RNA質量的檢測結果

用Plant RNA Kit植物RNA提取試劑盒可從患病葉片上提取到較完整的總RNA，在凝膠中可見28S、18S和5S 3條清晰的條帶，提取的總RNA滿足后續試驗要求。提取樣品RNA的A260/A280比值在1.7～1.9，表明組織中的蛋白質和酚類物質基本去除，所提取的RNA純度較理想，可用于后續研究。

2.2 病毒CP全長基因擴增結果

以PVX、PVY、PVS、PLRV 4 種病毒的反轉錄產物cDNA作為PCR反應的模板，分別使用各病毒特異性引物擴增得到4種病毒PLRV、PVS、PVX、PVY的CP基因全長片段。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分別得到大小為628、931、831、858 bp的4條特異性條帶(圖1)。電泳結果表明，PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長的擴增產物大小與引物設計產物大小相同。

圖1 馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白基因全長片段Fig.1 The amplified full-length CP genes of PLRV, PVS, PVX and PVY

2.3 PCR產物序列分析

割膠回收擴增的PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長片段，與pMD19-T vector進行連接，導入感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，質粒經酶切和PCR驗證后測序。測序結果經BLAST分析表明所得序列與NCBI參考序列的同源性分別達到96%、99%、97%、99%，證明了RT-PCR檢測結果的可靠性。

2.4 建立多重RT-PCR

將含有PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長的質粒按照1∶1∶1∶1比例混合成為PCR模板，并作為陽性對照。針對PVX、PVY、PVS、PLRV的CP保守基因設計引物(表1)，經單重PCR擴增分別得到大小為138、421、516和330 bp的4條特異性條帶。先采用和單重PCR相同的反應體系，4對引物按照1∶1∶1∶1比例配成混合引物，25 μL體系中加入1 μL混合引物，采用54 ℃的退火溫度，混合質粒作為模板，脫毒馬鈴薯cDNA作為陰性對照。多重PCR結果顯示陰性對照未擴增出條帶，PVX和PVS條帶較弱，PLRV與PVX之間有隱約出現非特異性條帶。

2.5 多重RT-PCR反應體系優化

2.5.1 dNTP濃度優化

在多重PCR反應中，dNTP濃度過高時PCR的反應將會被迅速抑制而且容易出現非特異性條帶。當dNTP的濃度過低時，擴增目的片段的產量將會大大降低。在25 μL反應體系中dNTP由0.75 μL降低到0.5 μL后，PLRV與PVX條帶之間非特異性條帶消失，25 μL PCR反應體系中加入0.5 μL dNTP，dNTP終濃度為0.05 mmol/L時擴增效果最好。

2.5.2 多重PCR反應引物優化

多重PCR反應中引物的設計至關重要，引物的特異性、幾對引物的退火溫度、引物間的配對、各目的片段之間的非特異性擴增均影響多重PCR的擴增效果。設計引物時應考慮:(1)根據CP基因的高度保守區設計4對引物，引物相互之間及與其他病毒之間均無同源性；(2)各對引物的最佳退火溫度盡量一致，相差最多不超過3 ℃；(3)目的條帶之間大小不要差距過大，彼此差距應保持在100 bp之內，這樣各目的條帶能有相近的擴增效率，并且凝膠電泳易辨別區分。先用Primer 6.0設計搜索引物，然后MFEprimer 2.0分析評價引物。MFEprimer 2.0是基于多因素(序列相似性、引物3′端穩定性、Tm值、自由能、PCR反應離子濃度等)的引物特異性評估系統，而且可以通過基于引物與模板的相似性分析來預測非特異性PCR產物[21]。重新設計引物，將PVX擴增片段大小由138 bp改為202 bp，在相同的擴增條件下4種病毒條帶都很亮，利用模擬電泳圖預先觀察電泳檢測結果(圖2)。實際電泳結果與模擬電泳結果一致。

圖2 模擬與實際擴增4種病毒特異性條帶Fig.2 Simulated and actual amplification of four kinds of virus-specific bands

2.5.3 輔助劑

使用一定濃度的輔助劑能夠改進多重PCR反應的特異性。在多重PCR反應中，4%～10%的DMSO可改進某些目的片段的擴增效率，但同時也會減少其他目的片段的擴增。在PCR反應體系中加入1 μL PCR輔助劑DMSO[21-22]，結果顯示4條擴增條帶均變亮，獲得較好的擴增效果。

2.6 多重RT-PCR反應條件優化

反應條件包括退火溫度、循環數等,劉正斌[13]和王鳳格[14]等人的研究表明在單一PCR擴增已經成功的條件下，遵循引物組合的一般原則，應用與單一PCR完全相同的反應條件進行多重PCR反應，結果大部分組合都得到了正常的擴增結果。所以只要選用與穩定有效的單一PCR相同的反應條件，并遵循引物組合的一般原則，就能夠直接應用到多重PCR中去，而不需要進行大量繁瑣的優化程序。

在多重PCR反應中，退火溫度是一個最重要的調整因素。在設計引物時就應該考慮將各對引物退火溫度控制在一個相近的范圍內，本試驗設計PVX退火溫度是55 ℃，PLRV退火溫度是57.5 ℃，PVY退火溫度是56.3 ℃，PVS退火溫度是57 ℃，各引物的退火溫度接近。Henegariu等[23]的研究表明，盡管單個目的片段能夠在56～60 ℃特異性地擴增，但是在多重PCR反應中，降低2～4 ℃的退火溫度能夠更好地用于所有目的片段的擴增。使用55 ℃作為多重PCR退火溫度，結果顯示所獲得的目的條帶較好。

循環內延伸時間為1 min,最后的延伸時間為15 min擴增效果較好，擴增產物加尾整齊。循環次數30次就能有效獲得特異而清晰的目的條帶。因此，優化后反應條件最終選擇退火溫度55 ℃，循環內延伸時間1 min，最后延伸15 min，30次循環。最終的優化結果見圖3。

2.7 多重PCR檢測體系特異性檢測

選用田間感染馬鈴薯的常見病對建立的多重PCR檢測體系的特異性進行驗證，提取馬鈴薯環腐病、馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯青枯病、馬鈴薯灰霉病的DNA，以馬鈴薯A病毒和馬鈴薯類病毒RNA作為模板。結果顯示建立的多重PCR檢測體系在選擇的幾種病害中均未擴增出條帶，說明針對馬鈴薯4種病毒的多重PCR檢測體系的特異性較好。

圖3 優化后的多重RT-PCRFig.3 Optimized multiplex RT-PCR

2.8 田間樣品檢測

采用優化后的多重RT-PCR檢測技術對田間樣品進行檢測，同時設置陽性和陰性對照。結果顯示，陽性對照完整擴增出4條條帶，陰性對照脫毒馬鈴薯中未擴增出任何條帶，樣品2和樣品6未擴增出4種病毒特異性條帶，樣品3、4和5擴增出PVS和PVY兩種病毒條帶，樣品7擴增出PVY和PLRV兩種病毒條帶(圖4)，表明4份樣品存在復合病毒侵染。

圖4 多重RT-PCR檢測復合病毒侵染的馬鈴薯葉片樣品Fig.4 Multiplex RT-PCR detection of complex infection of potato viruses

3 結論與討論

目前應用最廣的病毒檢測法是以病毒抗血清為基礎的酶聯免疫(ELISA)法。ELISA法比傳統的檢測方法靈敏度提高了許多，但存在假陽性或假陰性現象，也無法區分因外殼蛋白基因有一定同源性的病毒類型，并且無法檢測含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒。反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)具有靈敏、快速、特異性強等優點，多重RT-PCR繼承了單重PCR反應的優點，能同時在一個PCR反應中擴增出多個核酸片段，節省了模板、時間和費用，在檢測由復合病毒引起的病害時顯示出其優勢。

建立多重RT-PCR體系要比單重RT-PCR復雜得多，其中至關重要的原因是引物的設計[24]。多重RT-PCR的引物設計建議如下：(1)根據基因的高度保守區設計引物，引物相互之間及與其他基因之間均無同源性；(2)各對引物的最佳退火溫度盡量一致，相差最多不超過3 ℃；(3)目的條帶之間大小不要差距過大,應保持在100 bp左右，這樣各目的條帶能有相近的擴增效率，同時凝膠電泳結果應易辨別區分；(4)用Primer 6.0設計搜索引物，MFEprimer 2.0分析評價引物并模擬電泳的結果；(5)選用與穩定有效的單一PCR相同的反應條件。這樣就能夠直接應用到多重PCR中去，不需要進行大量繁瑣的優化程序。

對吳興泉等[25]提出的多重RT-PCR檢測馬鈴薯病毒中出現假陰性、假陽性、非特異性擴增問題，本研究都做了針對性的優化，在引物設計就已經盡可能將已公布的基因序列全部用于保守區的分析，本試驗用混合有4種病毒CP全長基因的質粒作為陽性對照，電泳時能夠直觀地看到陽性檢測結果，而且避免了因為試驗操作不當或者反應試劑問題導致的假陰性。對PCR試驗中所出現的假陽性DNA產物也能通過MFEprimer 2.0進行分析模擬電泳結果。本試驗建立的多重RT-PCR檢測體系能夠準確、特異地檢測復合侵染馬鈴薯的4種病毒，簡化了病毒檢測的工作量，進一步降低了成本，對于生產實踐有著重要的意義。

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Establishment of multiplex PCR for four potato viruses

Pang Bo，Liu Xiuli，Zhang Jinwen，Wang Di，Zhang Junlian

(Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, College of Agronomy,Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070, China)

Potato virus diseases are mainly caused by complex infection ofPotatovirusY (PVY)，PotatovirusX (PVX)，PotatovirusS (PVS), andPotatoleafrollvirus(PLRV). The primers for PVY, PVX, PVS and PLRV were designed based on the complete sequences of their coat protein (CP) genes and the sequence analysis of amplified fragments, which indicated that the four virus fragments shared at least 96 percent homology with other related viruses. The four pairs of specific primers based on the highly conserved sequences of the CP genes of the four viruses were designed. The target fragment sizes of 421 bp (PVY),202 bp (PVX), 516 bp (PVS) and 330 bp (PLRV) were amplified using multiplex RT-PCR. The optimized multiplex RT-PCR provides a quick and high efficiency method for simultaneous detection of the four viruses from field samples.

molecular detection； multiplex PCR； potato virus

2014-03-02

2014-05-07

國家自然科學基金(31260343)；甘肅省科技重大專項(1102NKDA025)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.018

* 通信作者 E-mail： jwzhang305@163.com