苜蓿夜蛾hsp90基因cDNA序列的克隆與表達研究

張 歡，劉洪娟，高艷玲，董天宇，趙奎軍，樊 東

(東北農業大學農學院，哈爾濱 150030)

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苜蓿夜蛾hsp90基因cDNA序列的克隆與表達研究

張 歡，劉洪娟，高艷玲，董天宇，趙奎軍，樊 東*

(東北農業大學農學院，哈爾濱 150030)

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物體適應外界不良環境條件的關鍵蛋白。熱休克蛋白90(HSP90)是HSP家族的重要成員。本試驗以苜蓿夜蛾為材料提取蟲體總RNA，利用RT-PCR和RACE技術，擴增得到hsp90基因全長cDNA序列，命名為Hvhsp90(GenBank登錄號KF636495)。該序列含有2 472個堿基，包括一個2 154個堿基的開放閱讀框，編碼一個含717個氨基酸的蛋白，分子量約為82.5 ku，等電點為4.97，且含有5個標簽序列及胞質特征序列MEEVD，推導的氨基酸序列與鱗翅目其他昆蟲HSP90相似性85%～99%之間。RT-PCR結果表明，該基因在苜蓿夜蛾不同發育時期和不同組織均有mRNA水平的特異性表達。該基因在大腸桿菌表達系統中進行了誘導表達, 經SDS-PAGE和Western blot檢測結果表明, HvHSP90能夠高效表達，并與預測的融合蛋白分子量相符。

苜蓿夜蛾； 熱休克蛋白90； 克隆； 表達

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)又稱熱激蛋白(heat stress proteins)，是生物體在應激情況下細胞內迅速合成的一類蛋白質，其誘導表達是昆蟲機體抵抗不良外界環境的重要形式之一，而且昆蟲體內熱休克蛋白的表達量越高，其抗逆性就越強。除了在高溫及其他不良環境因子脅迫下，多種應激源如重金屬、饑餓、缺氧和缺血等都可以誘導HSP的表達。HSP編碼序列變異比較低，在生物體內普遍存在、具有高度保守性[1]。Ritossa于1962年在試驗中發現，將黑腹果蠅(DrosophilamelanogasterLinnaeus)幼蟲的飼養溫度由25 ℃提高至30 ℃，30 min后，其唾液腺染色體上出現了特殊的“膨突”[2]。Tissieres于1974 年證實發生這種現象的原因是因為這個過程中產生了一系列分子量為70 ku和26 ku的蛋白質[3]，這些蛋白質被命名為熱休克蛋白。熱休克蛋白不但廣泛存在于原核、真核生物中，而且還存在于生物體的不同組織和細胞內。依據分子量的大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和一些小分子熱休克蛋白[4-5]，且不同物種的熱休克蛋白有很高的同源性[6]。熱休克蛋白對維持機體的穩態發揮著重要作用，目前已成為當今世界生命科學各個研究領域的熱點。

HSP90是HSPs家族中重要成員，除具有穩定蛋白質結構、參與細胞周期調控的作用，還在生物體的穩態維持中發揮重要作用，如應激損傷、腫瘤、自身免疫性等[7]。研究發現，HSP90在蛋白的折疊、蛋白降解和信號的傳導中發揮重要作用[8-10]，調節微生物體內蛋白，保護細胞活性，在形成真菌耐藥性的過程中也同樣起著重要的作用[11]。在正常或脅迫條件下的各種類型細胞胞質中都有存在，不論是在高等真核細胞還是在酵母中，HSP90都是和配體轉錄因子和細胞周期調控因子相互作用的，作為陪伴蛋白與變性蛋白結合，維持它們的折疊狀態，避免不可逆的損傷[12-17]，還可與蛋白激酶和類固醇激素受體等信號傳導蛋白相互作用并形成復合體，使其具有生物活性。在無脅迫條件下，HSP90也是真核生物必不可少的[18]，占細胞內可溶性蛋白的1%～2%[19]，對細胞在生理、病理及應激條件下的生存發揮著重要作用[20]。

苜蓿夜蛾[Heliothisviriplaca(Hüfnagel)]屬鱗翅目，夜蛾科，是大豆的重要食葉性昆蟲。目前，對苜蓿夜蛾的防治主要還是通過噴灑化學殺蟲劑這種傳統的方法來防除。本研究通過對苜蓿夜蛾HSP90基因cDNA序列進行克隆，獲取基因cDNA全長序列，并研究了該基因在不同組織和發育階段的表達情況，將該基因在大腸桿菌原核系統進行了成功表達，為苜蓿夜蛾分子生物學研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 昆蟲材料、試劑、質粒與菌株

于東北農業大學實驗實習基地大豆田采集苜蓿夜蛾幼蟲，室內用新鮮大豆葉喂養到不同蟲態備用。

RNA提取試劑盒TRIzolReagent為Invitrogen公司產品、反轉錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、低熔點瓊脂糖購自Promega公司；DL2 000 DNA Marker、 DNA膠回收試劑盒、克隆載體pMD18-T、Taqplus DNA聚合酶購自TaKaRa公司；受體菌DH5α、BL21和表達載體pET21b由本實驗室保存。一抗：碧云天生物技術研究所His-tag抗體；新型一步法快速WB試劑盒(鼠)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；DAB染色試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供。

1.2 蟲體總RNA的提取

提取苜蓿夜蛾5齡幼蟲蟲體總RNA，提取方法參照RNA提取試劑盒說明，提取的總RNA放入-80 ℃冰箱中備用。

1.3 利用RT-PCR和RACE技術克隆基因cDNA序列

1.3.1 利用RT-PCR克隆部分cDNA序列

對報道的兩種昆蟲谷實夜蛾[Helicoverpazea(Boddie)](GQ389710)和棉鈴蟲[Helicoverpaarmigera(Hübner)](HM593517)的hsp90核苷酸序列進行比較分析，設計一對引物hsp90(c)F: 5′-GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT-3′ 和hsp90(c)R：5′-CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA-3′。以Oligo (dt)3site-Ro-Ri primer：5′-ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC CAA AGC TTG AAT TCG AGC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3′為引物，所提取的總RNA為底物反轉錄合成cDNA，以hsp90(c)F和hsp90(c)R擴增苜蓿夜蛾cDNA序列的部分片段。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物回收，與pMD18-T vector連接，轉化DH5α，菌落在含有氨芐青霉素的平板上進行抗性篩選，對陽性克隆菌株進行酶切和PCR鑒定。連接正確的重組子由上海生工生物工程公司進行序列測定。

1.3.2 利用5′RACE克隆基因的5′端cDNA序列

利用TaKaRa 5′-Full RACE Kit克隆基因cDNA 5′端序列。根據已得到的cDNA片段和5′RACE試劑盒中的5′-RACE outer primer和5′-RACE inner primer分別設計引物Hvhsp90(5)outer primer： 5′-TCG ACC ACA CCC TTG ATG AAG TT-3′和Hvhsp90(5)inner primer：5′-CGC AGT TGT CCA TGA TGA ACA CCC TGC GG-3′，以引物5′-RACE outer primer 和Hvhsp90(5)outer primer進行第1輪PCR。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s；54.8 ℃，1 min；72 ℃，1 min 10 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。取首次擴增產物1 μL，用5′-RACE inner primer、Hvhsp90(5)inner primer引物進行第2次PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃，30 s；56.7 ℃，1 min；72 ℃，75 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物回收、與pMD18-T載體連接、轉化并測序。

1.3.3 克隆基因的3′端cDNA序列

根據得到的cDNA保守區序列設計2個克隆基因3′端的上游引物Hvhsp90(3)outer primer： 5′-CTG GCT GAC TTG CTC CGC TAC CAC ACA TCT G-3′和Hvhsp90(3)inner primer：5′-CCG CAT GAA GGA GAA CCA GAA ACA-3′。利用這2個引物與3′-RACE outer primer：5′-ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC C-3′和3′-RACE inner primer：5′-GGA TCC AAA GCT TGA ATT CGA GC TCT進行3′端cDNA序列克隆。以引物3′-RACE outer primer 和Hvhsp90(3)outer primer進行第1輪PCR。PCR 反應條件為: 94 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s；67 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。取首次擴增產物1 μL，用3′-RACE inner primer、Hvhsp90(3)inner primer引物進行第2次PCR擴增，擴增條件為: 94 ℃預變性3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，1 min；72 ℃，55 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增完成后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結果正確后用凝膠回收試劑盒回收，回收產物與pMD18-T載體連接、轉化、篩選、鑒定、序列測定，方法同上。

1.3.4 全長基因的克隆

對RT-PCR和RACE技術克隆得到的各個cDNA序列片段進行拼接得到全長cDNA序列，設計克隆基因全長序列的引物，一次性克隆獲得全長序列。

1.4 序列分析

用BioXM軟件對獲得的cDNA序列進行翻譯；ExPASy網站(http:∥ca.expasy.org/tools/)的Compute pI/Mw蛋白分析軟件推導氨基酸序列的分子量、等電點；SignalP 4.1 Server進行信號肽的預測；clustalx、MEGA5.0、boxshade軟件進行同源性比較和系統進化分析。

1.5 基因mRNA的時空表達研究

提取苜蓿夜蛾幼蟲取食期(5齡第2天)、預蛹期、蛹期第2天的蟲體和5齡第2天的6個組織(前腸、中腸、后腸、脂肪體、馬氏管、唾腺)的總RNA，3次重復。提取的RNA用DNA酶處理，反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

利用RT-PCR進行不同組織和發育階段表達的鑒定。擴增引物為5′-GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT-3′和5′-CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA-3′，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，28 s，30個循環；以β-actin作為對照，引物為： 5′-CCA ACG GCA TCC ACG AGA CCA-3′和5′-TCG GCG ATA CCA GGG TAC AT-3′，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min； 94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，20 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，PCR產物均經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 Hvhsp90基因的原核表達及重組蛋白的Western blot鑒定

設計表達引物Hvhsp90EcoRI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG和 Hvhsp90XhoI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG，以cDNA為模板擴增Hvhsp90的ORF，得到的目的基因的ORF和原核表達載體pET-21b(+)分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切；兩種酶切產物經切膠純化后，應用T4連接酶重新連接以獲得有基因插入的重組質粒，并命名重組質粒為hsp90-pET21b。將此重組質粒轉化至BL21感受態細胞中，活化后涂于加氨芐青霉素平板(Amp 50 μg/mL)，進行37 ℃過夜培養，挑取單菌落于加入氨芐青霉素的LB培養基中培養后提取質粒，利用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切并測序鑒定其正確性。次日1∶100接種于LB液體培養基，37 ℃培養至A600 nm為0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別在20 ℃和37 ℃下以160 r/min誘導培養12 h后，離心收集菌體，進行SDS-PAGE檢測。

將分離后的蛋白轉印PVDF膜85 min， 用4 ℃保存的TBS雜交膜清洗液洗滌2次，每次5 min。洗滌完成后用配制好的封閉液室溫孵育5 min，將膜從封閉液中取出后，浸入蒸餾水中，在水平搖床上以較大轉速漂洗2次，每次1 min。將一抗(His-tag抗體)，抗體反應液HRP(鼠)及抗體稀釋液混合而成的抗體孵育液加至膜上，于水平搖床上以適當速度室溫孵育40 min左右。將膜放入蒸餾水中漂洗30 s，再用洗滌液漂洗3 min，之后再用蒸餾水漂洗30 s。經充分洗滌后用DAB染色試劑盒顯色鑒定表達產物。

2 結果與分析

2.1 hsp90基因cDNA序列的獲得

利用RT-PCR技術擴增出苜蓿夜蛾hsp90部分cDNA序列，用BLAST軟件搜索，找到同源性較高的序列均為昆蟲hsp90 cDNA序列，初步斷定這段cDNA序列屬于昆蟲hsp90全長cDNA序列的一部分。利用獲得的序列設計克隆基因5′ 和3′ 端的引物，克隆得到基因的5′ 和3′ 端序列，經過序列拼接和全長基因測序得到基因包括完整開放讀碼框在內的cDNA序列，命名為Hvhsp90。GenBank登錄號為KF636495。該基因的cDNA序列及其推導的氨基酸序列見圖1。

2.2 hsp90基因cDNA序列和氨基酸序列分析

苜蓿夜蛾hsp90 cDNA序列含有2 472個堿基，5′端有1個151個堿基的非編碼區，3′端含有1個162個堿基的非編碼區，包括一個2 154個堿基的開放讀碼框，編碼717個氨基酸組成的多肽，分子量為82.5 ku，多肽的等電點4.97。多肽的13～14位為信號肽切割位點，在36～55(NKEIFLRELISNSSDALDKIR)、102～110(LGTIAKSGT)、126～141(IGQFGVGFYSCYLVAD)、347～356(IKLYVHRVFI)與372～387(GVVDSEDLPLNISRE)為HSP90家族標簽序列，C端保守序列為MEEVD。所獲得的序列符合HSP90家族所特有的氨基酸序列特征[4]，因此確認該序列是苜蓿夜蛾hsp90基因完整編碼區cDNA序列。

2.3 HvHSP90氨基酸序列比對

Hvhsp90核苷酸序列所推導的HvHSP90與已經克隆得到的其他鱗翅目HSP90序列進行了比對。結果表明，苜蓿夜蛾HSP90與夜蛾科的谷實夜蛾(H.zea)(GQ389710)、棉鈴蟲(H.armigera)(HM593517)、斜紋夜蛾[Spodopteralitura(Fabricius)](GU230735)、煙實夜蛾[H.assulta(Guenée)](GU230739)一致性達到99%，與另外幾種夜蛾科昆蟲甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)](FJ524853)、甘藍夜蛾[Mamestrabrassicae(Linnaeus)](AB251894)、東方黏蟲(MythimnaseparataWalker)(GU230737)一致性達到98%，與其他幾種鱗翅目昆蟲的一致性也在85%以上，如表1。

表1 不同鱗翅目昆蟲HSP90基本特征及與苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列的一致性1)

1)帶*號的為本研究克隆得到基因的氨基酸序列。

*, the amino acid sequence determined in this study.

圖2 鱗翅目昆蟲HSP90氨基酸序列系統進化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on HSP90 amino acid sequences of lepidopteran insects

對苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列與已經克隆得到的其他鱗翅目HSP90序列進行系統進化分析，構建進化樹(圖2)。系統進化分析結果發現，苜蓿夜蛾的熱休克蛋白與同一科的煙實夜蛾、棉鈴蟲、谷實夜蛾、斜紋夜蛾關系較近，繼而與同一目的其他科的關系較近，但與非鱗翅目昆蟲關系較遠(數據未列出)。

2.4 苜蓿夜蛾hsp90基因mRNA在不同組織中表達

組織特異性表達結果表明，hsp90在苜蓿夜蛾幼蟲取食期(5齡第2天)、預蛹期、蛹期(蛹殼形成第2天)等不同發育階段和5齡幼蟲的馬氏管、唾腺、中腸、脂肪體、前腸、后腸等不同組織中均有表達(圖3)，結果表明hsp90基因在昆蟲的多個組織中均表達。

2.5 HSP90原核表達和重組蛋白的免疫印跡分析

重組載體hsp90-pET21b轉化到宿主菌株BL21，并測序驗證與本試驗克隆所得Hvhsp90無任何堿基突變后確定為陽性克隆，并在菌株中進行異源表達，經IPTG誘導后用10%的凝膠進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色檢測結果顯示，含hsp90-pET21b的菌株表達出大小約82.5 ku的特異性蛋白條帶(圖4)，與理論大小相符，而未插入目的基因的空質粒在相應的位置未出現特異性片段的高效表達。

圖3 苜蓿夜蛾hsp90基因在不同發育階段與不同組織中的表達Fig.3 hsp90 expression in different developmental stages and different tissues of Heliothis viriplaca

表達產物經SDS-PAGE膠分離，再經轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色后，Western blotting結果表明在82.5 ku左右處有一條明顯的雜交帶出現(圖4)，與目標蛋白分子量大小完全吻合，表明該重組質粒可以在重組菌中穩定表達。

圖4 融合蛋白表達的SDS-PAGE和Western blotting 鑒定結果分析Fig.4 Analysis of SDS-PAGE and Western blotting of purified recombinant protein

3 討論

昆蟲在自然界中遭受到高溫脅迫或其他誘導等情況時產生熱休克蛋白，它是當今生物抗逆研究的重要內容。該序列含有5個HSP90家族簽名序列和C端保守序列MEEVD。通過與其他鱗翅目昆蟲HSP90蛋白進行同源性比對和系統進化分析，可以明顯看出Hvhsp90所編碼的蛋白與夜蛾科的谷實夜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、甘藍夜蛾等昆蟲HSP90同源性較高，而與鱗翅目非夜蛾科昆蟲同源性相對較低。同時，GenBank上登錄的棉鈴蟲有3條hsp90基因，甜菜夜蛾[21-22]和東方黏蟲中有2條hsp90基因，說明同種昆蟲中存在多種不同類型hsp90基因。可在后續的研究中繼續克隆苜蓿夜蛾的其他hsp90基因，進一步完善昆蟲hsp90基因拷貝數研究。

不同時期和不同組織的表達結果表明，hsp90在苜蓿夜蛾的多個發育階段和組織均有表達，進一步證實HSP90的生物學功能的重要性。本研究只進行了表達的定性分析，不同發育階段和組織表達量的差異、不同組織和不同發育階段的昆蟲在高溫、低溫下的表達量的變化以及該基因沉默時昆蟲對外界環境變化的反應可進一步利用實時熒光定量和RNAi技術進行深入研究。

構建的原核表達載體hsp90-pET21b在20 ℃和37 ℃誘導表達，經SDS-PAGE分離和Western blotting驗證，兩個溫度下該載體均能夠在大腸桿菌中高效表達出重組的融合蛋白，且均為包涵體蛋白。該表達系統能否表達出可溶性蛋白可通過進一步的條件優化進行探討或者利用其他真核表達系統進行研究。表達蛋白的獲得為下一步制備單克隆抗體及其生理功能研究奠定基礎。

相關研究表明，昆蟲經不同溫度處理，體內的hsp90表達量隨溫度的升高明顯升高[23-24]，表明產生hsp90是昆蟲抵御外界不良環境因子的重要途徑之一。基于hsp90的重要作用，已有應用RNAi技術防治害蟲的報道，如赤擬谷盜注射dsRNA后，蟲體的繁殖率下降，壽命明顯縮短[25]。本文克隆的全長cDNA序列為進一步研究苜蓿夜蛾的溫度耐受能力和相關分子生物學研究奠定基礎。

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cDNA cloning and expression of hsp90 from Heliothis viriplaca

Zhang Huan, Liu Hongjuan, Gao Yanling, Dong Tianyu, Zhao Kuijun, Fan Dong

(College of Agronomy, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Heat shock proteins(HSPs)are key elements of the organism’s adaptive response to adverse environment. HSP90 family is an important member of HSP superfamily. By using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques, the full-length HSP90 cDNA sequence was obtained from the marbled clover,Heliothisviriplaca(Hüfnagel) and designated as Hvhsp90 (GenBank accession no. KF636495). The cDNA sequence of Hvhsp90 was 2 472 bp, including an open reading frame of 2 154 bp encoding a polypeptide of 717 amino acids with an estimated molecular mass of 82.5 ku and an estimated isoelectric point of 4.97. The amino acid sequence contained five signature sequences of HSP90 family and a C-terminal cytoplasmic character sequence (MEEVD). Sequence alignment showed that HvHSP90 shared 85%-99% identity with HSP90 sequences reported in other lepidopteran insects. mRNA transcripts were expressed during various developmental stages and in different tissues based on RT-PCR. SDS-PAGE and Western blot results revealed that HvHSP90 was expressed successfully inE.coli. The molecular weight of the expressed protein was consistent with the predicted molecular weight of HvHSP90.

Heliothisviriplaca; heat shock protein 90; cloning; expression

2014-02-24

2014-05-20

國家現代農業產業技術體系(CARS-4)

Q 785

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.005

* 通信作者 Tel:0451-55191643；E-mail：dnfd@163.com