西藏設施茄子鐮孢根腐病病原的分離及鑒定

楊成德, 王 振, 代萬安, 郝蓉蓉, 劉心剛, 楊 杰

(1.甘肅農業大學草業學院草業生態系統教育部重點實驗室, 甘肅省草業工程實驗室, 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,蘭州 730070; 2. 西藏自治區農牧科學院蔬菜研究所, 拉薩 850032)

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西藏設施茄子鐮孢根腐病病原的分離及鑒定

楊成德1, 王 振1, 代萬安2, 郝蓉蓉1, 劉心剛1, 楊 杰2

(1.甘肅農業大學草業學院草業生態系統教育部重點實驗室, 甘肅省草業工程實驗室, 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,蘭州 730070; 2. 西藏自治區農牧科學院蔬菜研究所, 拉薩 850032)

本試驗對西藏設施茄子鐮孢根腐病癥狀和病原進行了研究。結果表明,其癥狀主要表現為植株根部或莖基部逐漸腐爛,后導致整個植株萎蔫枯死。根據病原菌形態特征及ITS序列分析結果,將致病菌鑒定為層出鐮孢(Fusariumproliferatum),該病原菌的最適生長溫度為30 ℃,最適碳源為樹膠醛糖和甘露糖,最適氮源為硝酸鈉;研究結果為該病害的綜合防治提供依據。

茄子根腐病; 鑒定; 生物學特性

隨著生活水平的提高,對蔬菜的需求量越來越大,且正向新鮮和安全的潔凈蔬菜轉變[1]。有“世界屋脊”之稱的西藏自治區從20世紀80年代在拉薩城關區蔡公堂鄉、堆龍德慶縣及林芝地區等地新建溫室或大棚進行設施蔬菜生產,極大地滿足了當地人民對各種蔬菜的需求,蔬菜播種面積由1985年占農作物播種面積的1.61%提高到2011年的9.49%[2]。隨著蔬菜種植年限的增長,根腐病發生越來越重,主要原因是溫室大棚修建之后多年不移動,使用的土地相對固定,且在溫室和大棚種植的蔬菜主要集中在茄科和葫蘆科,輪作倒茬困難,使土壤中病原菌逐年積累;另一方面,農戶對預防為主的防控策略重視不夠,如在土壤消毒、無病土育苗及有機肥充分腐熟等方面做得不到位,沒有徹底清潔溫室環境,病殘體隨意處理,造成人為傳播嚴重。設施蔬菜生產是農業增效、農民增收的重要途徑之一,也是促進農牧區農業經濟發展的重要措施之一。但根腐病成為制約設施蔬菜生產的主要問題之一,同時根腐病的發生對新種植戶的積極性打擊較大,對設施蔬菜的示范推廣造成一定困難,也對市場蔬菜的供應產生了影響[3]。因此,2011年對西藏拉薩郊縣和林芝等地區設施茄子生產地進行了根腐病調查,以期明確設施茄子鐮孢根腐病菌的種類和發生程度,為綜合防治提供依據,也為設施蔬菜的持續發展提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試病原菌：分離自西藏自治區拉薩市城關區設施茄子根部的鐮孢菌(Fusariumsp.)。

供試培養基[4]：PDA培養基和PSA培養基用于病原菌的分離和純化;PS液體培養基用于病原菌DNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 癥狀的描述及病原的分離與純化

在西藏自治區拉薩市城關區蔡公堂鄉對典型病株進行癥狀描述后采集病株帶回實驗室,按照常規組織分離法分離病原菌,在PSA培養基上進行培養與純化,將純化獲得的菌株黑暗培養,待產孢后進行單孢分離[5],進一步純化后移入PSA斜面培養保存備用。

1.2.2 致病性測定

在實驗室采用根部接種法,將供試菌株用無菌水配制成孢子懸浮液(約 106個/mL)，取約10 mL接種到健康茄子植株根圍,以無菌水為對照,后連續觀察植株的發病情況,形成典型癥狀后,對病原菌進行再分離,按柯赫氏法則確定病原菌。

1.2.3 不同溫度對菌絲生長的影響

采用生長速率法。經活化的病原菌用0.5 cm直徑的打孔器切取菌餅,接種到PSA平板中央,置于0、5、10、15、20、25、30、35和40 ℃下培養, 5次重復,5 d后用十字交叉法測量菌落直徑,所得數據用Excel軟件作圖。

1.2.4 不同碳氮源對菌絲生長的影響

將病原菌接種于含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-樹膠醛糖、麥芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、D-果糖)和含0.25%氮源(氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、硝酸鈉、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-組氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸)的馬鈴薯瓊脂培養基后置于最適溫度下培養,分別以不加碳氮源的水瓊脂為對照,5次重復,5 d后用十字交叉法測量菌落直徑,所得數據用Excel軟件作圖。

1.2.5 病原菌的鑒定

1.2.5.1 形態學鑒定

將經致病性測定的病原菌培養產孢后,在顯微鏡(10倍×40倍)下觀察分生孢子梗和分生孢子特征,測定100個分生孢子大小,并顯微拍照。根據病原形態、大小,查閱相關資料[6-8],確定屬種。

1.2.5.2 基因序列分析鑒定

病原菌經活化培養后取50～100 mg新鮮菌絲,液氮中充分研磨成粉末,采用上海生工生物工程技術服務有限公司的UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。選取由上海生工生物工程有限公司合成的通用引物ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)進行PCR擴增;擴增體系為50 μL,即10×PCR buffer 5.0 μL,TaqDNA聚合酶(2 U/μL)1.2 μL,ITS1 (10 mmol/L)2.0 μL,ITS4 (10 mmol/L)2.0 μL,dNTPs (10 mmol/L)3.0 μL,DNA模板(10 ng/μL)2.0 μL (以加2.0 μL ddH2O為陰性對照),ddH2O 34.8 μL;擴增程序為95 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,30 個循環;72 ℃終延伸10 min。將具特異性條帶的PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序;所測序列提交到GenBank數據庫進行相似性比較,并與GenBank中的相似序列在Claustal 1.8程序包中進行多重序列匹配排列分析,最后形成一個多序列匹配排列陣,用MEGA 4.0程序包中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹,明確其系統發育地位。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

茄子發病后,初期表現為葉片變黃,生長緩慢,后下部葉片萎蔫下垂,植株莖基部或根部表皮逐漸腐爛,并與木質部分離,最后整個植株萎蔫枯死,潮濕時發病部位有白色霉層。

2.2 病原的分離和致病性測定

利用常規分離方法獲得6株鐮孢霉屬真菌,經室內接種只有1株可以引起典型癥狀,并從發病植株上再次分離到了所接種的菌株,表明該鐮孢霉菌即為茄子鐮孢根腐病的病原菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 形態學鑒定

從拉薩市城關區分離的茄子鐮孢根腐病的病原菌菌落白色,均勻隆起,絨狀,較厚,菌背白色;菌絲無色,有隔,直徑1.2～3.5 μm,有球狀膨大體;大型分生孢子馬特型,稍彎曲,隔膜不清晰(圖1),大小(18.8～23.5)μm×(2.4～2.9)μm;小型分生孢子短桿狀,兩端圓,較多,大小(5.9～11.8)(8.2)μm×(1.4～2.4)(1.8)μm;產孢梗單瓶梗,大小(9.4～37.6)(17.9)μm×(1.8～2.9)(2.1)μm。根據其形態特征鑒定其為鐮孢屬真菌Fusariumsp.,種待定。

圖1 茄子鐮孢根腐病菌的大型分生孢子Fig.1 The macroconidia of eggplant Fusarium rot

2.3.2 病原ITS鑒定

經PCR擴增和測序,病原菌rDNA-ITS的堿基長度為563 bp,在系統發育樹中,茄子鐮孢根腐病病原菌與GenBank中層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)(FJ040179)聚在一起(圖2),且相似性在99%以上,結合形態特征鑒定其為層出鐮孢菌(F.proliferatum)。

圖2 茄子根腐病菌的系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree of Fusarium proliferatum

2.4 病原生物學及培養性狀測定

2.4.1 生長溫度測定

圖3表明,茄子層出鐮孢菌在10～40 ℃均可生長,適宜溫度為25～35 ℃,最適溫度為30 ℃。

2.4.2 碳源利用能力測定

圖4表明,茄子層出鐮孢菌對供試的11種碳源均可利用,在以乳糖為碳源的培養基上生長最慢,菌落直徑只大于水瓊脂對照1.1 cm;在以D-樹膠醛糖和甘露糖為碳源的培養基上生長最快,菌落直徑大于對照(水瓊脂)2.7 cm;在其他供試碳源上生長速率差異不明顯,但菌落直徑均大于水瓊脂培養基上的菌落直徑。

圖3 溫度對茄子層出鐮孢菌菌絲生長的影響Fig.3 The effect of temperature on mycelium growth of Fusarium proliferatum

圖4 碳源對茄子層出鐮孢菌菌絲生長的影響Fig.4 The effect of C-source on mycelium growth of Fusarium proliferatum

2.4.3 氮源利用能力測定

圖5表明,茄子層出鐮孢菌對供試的12種氮源均可利用,在以碳酸銨、L-谷氨酸為氮源的培養基上生長最慢,菌落直徑小于水瓊脂對照2.3～4.0 cm;在以氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、大豆蛋白胨、亮氨酸和蛋白胨為氮源的培養基上生長速率差異不大,但均高于水瓊脂對照,說明這些供試氮源對該病原菌有促進作用。

3 結論與討論

鐮孢菌(Fusariumspp.)因其在無性階段產生的大型分生孢子形似鐮刀而得名。1809年Link首先從錦葵科植物上發現第一株鐮孢菌,定名為粉紅鐮孢菌(F.roseumLink)。鐮孢菌種類多,迄今已發現40余種,普遍存在于土壤及動植物有機體內,其中不少是導致多種農林植物病害的病原菌。鐮孢菌的分類鑒定是一項十分復雜的工作,一般植物病原真菌主要依據營養體和子實體進行鑒定[9-10],但是,大部分鐮孢菌形態相似,且一些鐮孢菌的產孢條件難于摸索[11],利用鐮孢菌形態特征在種水平上進行鑒定并非易事。近年研究表明真菌rDNA的ITS 區段既具保守性,又在科、屬、種水平上均有特異性,因此,常常將這一可變區作為真菌種和分離物鑒定的可靠依據之一[12-13],如Volossiouk[14]根據 ITS序列設計合成的引物ITS-Fu-f和ITS-Fu-r在棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)的專化性和靈敏度方面做了深入研究。本研究采用形態學和分子鑒定相結合的方法,將致病菌鑒定為層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum),該菌有侵染玉米的報道[15],但侵染茄子為首次報道。

圖5 氮源對茄子層出鐮孢菌菌絲生長的影響Fig.5 The effect of N-source on mycelium growth of Fusarium proliferatum

該病原菌生物學特性研究表明,病原菌生長最適溫為30 ℃,能夠在10～40 ℃條件下生長,溫度過高或過低對菌絲生長均不利;在供試的所有碳源中,最佳碳源是樹膠醛糖和甘露糖;氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、大豆蛋白胨、亮氨酸和蛋白胨等氮源對菌絲生長有促進作用,但差異不顯著,碳酸銨、谷氨酸可抑制

該病原菌的生長。本試驗較全面地研究了西藏設施茄子鐮孢根腐病的癥狀和病原的培養性狀及生物學特性等,且利用ITS序列分析對其進行了鑒定,為西藏設施茄子根腐病的診斷和綜合防治提供依據。

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(責任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of the pathogen of eggplant root rot in Tibet Autonomous Region

Yang Chengde1, Wang Zhen1, Dai Wan’an2, Hao Rongrong1, Liu Xingang1, Yang Jie2

(1. College of Prataculture, Gansu Agricultural University; Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education;Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province; Sino-U.S.Center for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Vegetables, Tibetan Institute of Agriculture and Animal Husbandry, Lhasa 850032, China)

The symptoms and pathogen of eggplant root rot were studied. The results showed that the symptom was rot of roots or stems, and then the plants wilted. Based on morphological characteristics and ITS sequence analysis, the pathogenic fungus was identified asFusariumproliferatum. The optimum growth temperature was 30 ℃. The optimum carbon source were arabinose and mannose, and the optimum nitrogen source was sodium nitrate. This study provided a foundation for controlling the disease.

eggplant root rot; identification; biological characteristics

2014-03-17

2014-05-12

西藏自治區科技廳重點科研項目(2012年)

S 436.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.024

聯系方式 E-mail: yangcd@gsau.edu.cn