云南省玉溪市玉米致死性壞死病毒原的分子鑒定

李 帥, 朱 敏, 夏子豪, 王 廿, 周 濤,董家紅, 陳永對, 張仲凱, 范在豐*

(1. 中國農業大學植物病理學系, 北京 100193; 2. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所, 昆明 650223)

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研究簡報ResearchNotes

云南省玉溪市玉米致死性壞死病毒原的分子鑒定

李 帥1#, 朱 敏1#, 夏子豪1, 王 廿1, 周 濤1,董家紅2*, 陳永對2, 張仲凱2, 范在豐1*

(1. 中國農業大學植物病理學系, 北京 100193; 2. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所, 昆明 650223)

玉米致死性壞死病是由玉米褪綠斑駁病毒(Maizechloroticmottlevirus, MCMV)和一種或多種馬鈴薯Y病毒科病毒復合侵染引起的。2014年1月在對云南省玉溪市玉米病毒病害的調查中發現了一些表現嚴重花葉、矮化葉片甚至整個植株壞死癥狀的玉米。對采集樣品進行RT-PCR檢測,所有樣品中都同時檢測到了MCMV和甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus, SCMV),在一個樣品中同時檢測到了MCMV、SCMV和南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus)。

玉米致死性壞死病; 玉米; RT-PCR

玉米致死性壞死病(corn lethal necrosis, CLN或maize lethal necrosis disease, MLND)最早于1973年發現于秘魯[1],隨后在美國的堪薩斯州和內布拉斯加州也發現了該病害[2]。該病害是由玉米褪綠斑駁病毒(Maizechloroticmottlevirus, MCMV)和馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)中侵染禾本科植物的病毒[例如小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)、玉米矮花葉病毒(Maizedwarfmosaicvirus, MDMV)、甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus, SCMV)]復合侵染后發生協生作用而導致的,其癥狀表現為褪綠斑駁、花葉,葉片壞死,甚至整個植株壞死。玉米產量損失嚴重時高達90%[1-4]。周雪平課題組于2011年首次報道了MCMV和玉米致死性壞死病在我國云南省的發生[5]。

MCMV主要分布在阿根廷、墨西哥、秘魯和美國等國家,近年已擴展到亞洲和非洲的部分玉米種植區[6-8]。在臨近云南省北部的四川省攀枝花地區的玉米標樣中也檢測出了MCMV[9]。該病毒的寄主限于禾本科植物(包括玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱等),可以通過機械摩擦[1-4]和種子[7]傳播。MCMV的夏威夷分離株可由玉米花薊馬(威廉斯花薊馬Frankliniellawilliamsi)傳播[8],從泰國進境的分離株可由西花薊馬(F.occidentalis)傳播[10]。用MCMV-Kansas株系作毒原研究發現葉甲科的谷物葉甲(Oulemamelanopa)、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria)、紅頭跳甲(Systenafrontalis)、南部玉米食根葉甲(Diabroticaundecimpunctata)、北部玉米食根葉甲(D.longicornis)和西部玉米食根葉甲(D.virgifera)等6種昆蟲是MCMV的傳播介體,以非持久性方式傳毒[11]。受該病毒侵染的玉米在侵染初期主要表現出輕度的褪綠斑駁,逐步發展為黃色條紋,甚至還引起雌花的畸形和植株的矮化等。MCMV屬于番茄叢矮病毒科(Tombusviridae),玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus),病毒粒子為球狀,直徑約為30 nm;其基因組為正義單鏈RNA分子,全長為4 436～4 437 nt[12-13],包含7個開放讀框[13]。

SCMV是引起我國玉米矮花葉病的主要病原,其自然寄主限于禾本科植物。植株受侵染后主要表現為葉片不均勻褪綠而形成花葉、條紋等,重病株表現不同程度的矮化,不能抽穗,千粒重下降等。SCMV是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員,基因組為正義單鏈RNA分子,全長約為 9.6 kb[14]。SCMV基因組RNA編碼一個大的多聚蛋白和一個移碼蛋白,經病毒自身編碼的蛋白酶切割后形成11個成熟的蛋白質[14-15]。

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)是在我國首先發現的一種導致水稻黑條矮縮病的病毒[16-17]。該病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae),斐濟病毒屬(Fijivirus)[16-17],由白背飛虱以持久性方式傳播[17-18]。SRBSDV的基因組由10條雙鏈RNA組成[16]。

2014年1月,作者在對云南省玉溪市玉米病毒病害的調查中發現了一些表現嚴重花葉、矮化、葉片甚至整株壞死以及粗縮癥狀的玉米,嚴重地塊發病率達50%以上。采集了8個癥狀明顯的樣品提取葉片總RNA,使用MCMV,SCMV和SRBSDV的特異性引物進行RT-PCR檢測、序列測定和比對分析后,發現上述8個樣品中均含有MCMV和SCMV,其中1個表現粗縮癥狀的樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV 3種病毒的復合侵染。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年1月在云南省玉溪市元江縣采集表現嚴重花葉、矮化，葉片甚至整個植株壞死癥狀(圖1)的玉米植株8份,經整理后一部分用于病毒的檢測,其余樣品于-40 ℃保存備用。

圖1 玉米致死性壞死病的田間癥狀Fig.1 The symptom of maize lethal necrosis disease in the field

1.2 葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取玉米葉片總RNA。取約0.1 g的葉片用液氮研磨成粉末狀,迅速移入1.5 mL離心管中后立即加入1 mL TRIzol,劇烈振蕩混勻,室溫靜置5 min后加入200 μL氯仿,劇烈振蕩20 s再于室溫靜置3 min后于4 ℃,12 000g離心15 min,取上層水相(約500～550 μL)轉移到新的1.5 mL離心管中,加入等體積的異丙醇,混勻后于室溫靜置10 min,然后于4 ℃,12 000g離心10 min后用75%乙醇洗滌沉淀2次。最后用DEPC處理的ddH2O溶解沉淀。

1.3 反轉錄PCR、序列克隆和測定

以2 μg總RNA為模板,加入0.5 μL Oligo(dT)引物(0.5 μg/μL)(Promega公司),0.5 μL隨機六聚體引物(Promega公司)(10 μmol/L),1 μL dNTPs(10 mmol/L),4 μL 5×RT緩沖液,0.5 μL核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor),1 μL M-MLV(Promega公司),最后加入DEPC處理的ddH2O將反應體系補齊至20 μL,充分混勻后于37 ℃反應60 min。

以反轉錄得到的cDNA為模板,分別用檢測SCMV,MCMV和SRBSDV的特異性引物進行PCR。各檢測引物的序列、退火溫度、目的片段長度及參考文獻見表1。50 μL PCR反應體系如下：2 μL cDNA,5 μL 10×Taq緩沖液,1 μL dNTPs(10 mmol/L),上下游檢測引物(10 μmol/L)各2 μL,0.4 μL GoldenTaqDNA 聚合酶,37.6 μL ddH2O。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min;按以下條件進行30個循環：94 ℃變性30 s,50或58 ℃(視引物的Tm值而定)退火30 s,72 ℃延伸(延伸時間視目標片段大小而定);最后72 ℃延伸10 min。所有PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳分析后,切取目標條帶,經天根公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后克隆到pMD18-T載體(TaKaRa,大連)。連接產物轉化大腸桿菌DH5α菌株,取陽性克隆測序獲得序列。

表1 檢測使用引物信息1)

1) Y=C/T;N=A/G/C/T;R=A/G;V=A/G/C

1.4 序列比對和分析

利用NCBI網站(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上的BLAST程序對克隆得到的序列進行比對分析,根據核苷酸序列的相似性確定病毒的種類。采用Clustal W(http:∥www.genome.jp/tools/clustalw/)進行相關核苷酸序列的初步比對運算,再用MEGA 6.06軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 樣品的RT-PCR檢測

以cDNA為模板,分別用SCMV、MCMV和SRBSDV的特異性引物進行PCR檢測。從采集的8個樣品中均擴增得到了約710 bp和約1 800 bp的條帶(圖2a,b),從5號樣品中擴增得到了約569 bp的條帶(圖2c)。結果表明8個樣品均被MCMV和SCMV侵染;5號樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV 3種病毒的復合侵染。

2.2 序列分析

將PCR獲得的目標片段純化,克隆到pMD18-T載體并進行序列測定。用BLAST程序進行序列相似性比對分析的結果表明：從云南玉溪市采集的8個玉米樣品中分離得到的710 bp片段的序列完全相同(MCMV-Yuanjiang 2,GenBank登錄號：KJ873134.1)與MCMV四川分離物(MCMV-Sichuan,GenBank登錄號：JQ982470.1)的序列一致率最高,為99%;從這8個樣品中擴增得到的約1 800 bp片段的序列與SCMV廣東分離物(SCMV-GD,GenBank登錄號：AJ310105.1)的序列一致率最高,均為98%;而從5號樣品中擴增得到的569 bp片段的序列與SRBSDV云南分離物(SRBSDV-YN,GenBank登錄號：JQ773428.1)的序列一致率最高,為100%。表明,在云南省玉溪市采集的8個玉米樣品均受到MCMV和SCMV的復合侵染,其中5號樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV這3種病毒的復合侵染。

圖2 利用反轉錄PCR檢測發病玉米樣品中SCMV,MCMV和SRBSDVFig.2 Detection of SCMV, MCMV and SRBSDV in diseased maize samples through RT-PCR

3 討論

玉米致死性壞死病是一種毀滅性的病毒病害,近年來在東南亞及非洲東部的部分國家和地區大面積發生[6, 21],造成了嚴重的經濟損失,威脅了當地的糧食安全。MCMV是玉米致死性壞死病的主要病原,也是我國進境檢疫性病毒,目前僅在我國的云南和四川兩省有發生[5, 9]。其在云南主要發生在冬春玉米上,嚴重時連片發生幾千畝。該病毒可由葉甲或薊馬傳播,也可經種子傳播[7-8,10-11]。我國植物檢疫部門多次從國外進境的玉米種子中檢測到MCMV[19, 21-22]。MCMV與馬鈴薯Y病毒科的一種或多種病毒的復合侵染，例如MCMV與SCMV復合侵染可導致玉米致死性壞死病的發生。我們的檢測結果顯示,從云南省玉溪市采集的玉米樣品中擴增得到的MCMV的片段序列與MCMV-Sichuan的序列一致率高達99%,將我國和部分美國的MCMV外殼蛋白基因繪制成系統發生進化樹(圖3),進化樹顯示我國的MCMV聚為一類且與美國的MCMV相似。從這批樣品中擴增得到的SCMV的片段序列與SCMV-GD的序列一致率高達98%。這表明這兩種病毒可能是通過種子攜帶在華南和西南地區傳播的。近年冬春季,許多育種單位在云南進行南繁育種,這可能是該類病害傳入云南的途徑之一。因此,加強對玉米種子調運的管理以及嚴格執行檢疫措施將有利于控制該病毒在國內外的傳播和擴散,對于預防和阻止玉米致死性壞死病的發生和蔓延具有重要作用[21-22]。此外,我國是全球主要的玉米消費國,每年從國外進口大量的玉米,加大對玉米種子的檢測力度也能在很大程度上防止各種檢疫性危險病毒的入侵。

圖3 MCMV不同分離物外殼蛋白基因的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the coat protein gene of different isolates of MCMV

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(責任編輯：楊明麗)

Molecular identification of the viruses causing maize lethal necrosis disease in Yuxi, Yunnan Province

Li Shuai1, Zhu Min1, Xia Zihao1, Wang Nian1, Zhou Tao1, Dong Jiahong2, Chen Yongdui2, Zhang Zhongkai2, Fan Zaifeng1

(1. Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Institute of Biotechnology and Germplasm Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China)

Maize lethal necrosis disease is caused by synergistic interaction betweenMaizechloroticmottlevirus(MCMV) and one or several potyviruses. Severe mosaic, leaf necrosis (even plant lethal necrosis) or rough dwarf were found during a survey on virus diseases in maize carried out in Yuxi District, Yunnan Province in January 2014. RT-PCR, molecular cloning and sequence analysis were performed to identify the viruses present in the sampled plants. The results showed that all of the diseased samples tested were co-infected with MCMV andSugarcanemosaicvirus(SCMV) and one of the plants was co-infected with MCMV, SCMV and Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV).

corn lethal necrosis disease; maize; RT-PCR

2014-03-25

2014-06-10

國家科技重大專項(2013ZX08003-001); 云南省科技計劃項目(2012CH007)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.021

* 通信作者 E-mail:dongjhn@126.com;fanzf@cau.edu.cn

# 對文章有同等貢獻，為并列第一作者