抗草甘膦轉基因大豆Cp4-epsps基因快速簡便的LAMP 檢測方法

朱琳峰, 彭 煥, 黃文坤, 張東升, 孔令安, 彭德良

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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抗草甘膦轉基因大豆Cp4-epsps基因快速簡便的LAMP 檢測方法

朱琳峰, 彭 煥, 黃文坤, 張東升, 孔令安, 彭德良*

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

針對抗草甘膦轉基因大豆的外源基因Cp4-epsps，建立了一種基于環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術的抗草甘膦轉基因大豆的檢測體系，其擴增產物既可利用常規瓊脂糖凝膠電泳檢測，還可通過SYBR Green I染色進行快速檢測。LAMP 檢測體系中dNTPs濃度為0.8 mmol/L、Mg2+濃度為3 mmol/L、反應時間為45 min時擴增效果最佳，其檢測靈敏度為5 μg/L，比常規PCR靈敏100倍。田間實際檢測結果表明，LAMP 檢測結果和PCR檢測結果完全一致，準確率為100%。本研究所建立的抗草甘膦轉基因大豆LAMP 檢測方法具有簡便快速、特異性強、靈敏度高等特征，是一種能夠用于抗草甘膦轉基因大豆檢測、田間基因漂移監測和環境安全研究的有力工具。

抗草甘膦轉基因大豆;Cp4-epsps; LAMP; 快速檢測

轉基因作物自研發以來,一直呈現迅猛增長的趨勢,據ISAAA 統計,截至2013年,轉基因作物種植面積已經達到1.752億hm2,較1996年增加了100倍以上。其中轉基因大豆的種植面積占全球轉基因作物種植面積的 47%,主要以抗草甘膦轉基因大豆為主。截至2013年6月,我國已經批準了11種轉基因大豆進口并用作加工原料, 但至今仍未批準轉基因大豆的商業化種植。缺乏合適、可靠、高效而又簡便的轉基因大豆基因漂移監測方法及其生態風險評價方法是一個重要的因素。近年來轉基因生物尤其是轉基因食品的安全問題成為公眾關注的熱門話題[1]。建立一套高效、準確的轉基因大豆檢測技術,對于抗草甘膦轉基因大豆的檢測和基因漂移的監測、促進中國轉基因大豆的商業化進展,加強轉基因大豆種植的田間監管,維護消費者在轉基因大豆食品安全上的知情權具有現實意義。

外源基因檢測與外源蛋白檢測是轉基因作物檢測的兩種常用方法。常用的外源蛋白檢測技術，如酶聯免疫吸附法(ELISA)[2-3]以及膠體金試紙條法[4]，操作簡便,結果易于判定,特異性好，方法實用有效,但是對于轉基因加工制品的檢測，其靈敏度較低[5],且價格昂貴,不適合在日常檢測中普及。外源基因的檢測主要通過PCR擴增進行,常用的檢測序列有啟動子序列、終止子序列以及外源基因等[6]。此外,研究者們還在PCR的基礎上開發出一些新的技術來增加檢測的特異性,如巢式PCR[7]、RT-PCR[8]、熒光定量PCR[9],Southern Blot[10]等。這些分子檢測手段具有高度的特異性及靈敏度,但是檢測耗時較長,操作繁瑣,對儀器、試劑有較高要求,因而不適宜在田間檢測。環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本學者Notomi 等[11]發明的一種新式恒溫核酸擴增技術,該技術應用4條引物特異性識別靶序列上的6個特異位點,在Bst酶的作用下,恒溫擴增30～90 min即可完成反應，其結果通過瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到典型的梯形條帶;Nagamine等[12]又在LAMP 4條引物的基礎上,增設了一對環引物,該引物直接與LAMP 反應過程中產生的“莖環”結構結合,從而將LAMP 反應時間縮短了一半以上。目前, LAMP 技術已經廣泛應用到轉基因作物的快速檢測中。Lee等[13]根據花椰菜花葉病毒35S啟動子(P-35S), 農桿菌胭脂堿合成酶啟動子(P-NOS)以及農桿菌胭脂堿合成酶終止子(T-NOS)的序列設計特異性LAMP 引物,用于轉基因油菜中的外源基因鑒定,但結果仍然是通過電泳檢測完成;,王永等[14]以轉基因作物中常用的花椰菜花葉病毒35S 啟動子(CaMV35S)為檢測靶標,利用LAMP 技術同時對7 種轉基因作物進行了LAMP 檢測,并添加SYBR Green Ⅰ熒光染料作為指示劑來判斷反應結果;陳金松等[15]將LAMP 法檢測應用于含有CaMV35S啟動子的轉基因玉米檢測中; Chen 等[16]將羥基萘酚藍(HNB)作為指示劑應用到轉基因水稻的LAMP 檢測中; Li 等[17]建立了轉基因水稻中的cry1Ab基因LAMP 檢測方法; Randhawa 等[18]針對啟動子(P-35S和P-FMV)及報告基因(aadA、nptII和uidA)等序列分別設計LAMP 引物,比較了5個LAMP 引物檢測轉基因棉花的靈敏度及效率,發現針對靶基因設計的LAMP 引物檢測靈敏度較高。

抗草甘膦轉基因大豆是通過Cp4農桿菌介導法將epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)基因轉移到植物體內,使之過量表達,從而使大豆獲得草甘膦抗性[19]。呂山花[20],王存芳[21]等采用常規PCR法對4種抗草甘膦轉基因大豆制品中的Cp4-epsps基因進行檢測,但由于豆制品加工過程損傷了DNA而導致檢測靈敏度較低;張明輝[22]等人采用實時熒光定量PCR的方法對大豆‘Roundup Ready’加工品中的Cp4-epsps基因進行檢測,該檢測方法靈敏度高,且無需電泳分析,但對儀器、試劑要求較高;蘭青闊等[23]根據Cp4-epsps基因開發出抗草甘膦轉基因大豆LAMP 檢測技術,但結果仍采用凝膠電泳進行判定。

本研究以抗草甘膦轉基因大豆外源基因Cp4-epsps為靶標,通過體系優化,靈敏度和特異性分析,建立了抗草甘膦轉基因大豆的LAMP 快速檢測體系,通過加入一對環引物大大縮短檢測時間。該檢測方法操作簡便,對儀器設備要求低,水浴鍋就可,且檢測結果肉眼即可判定,適用于基層檢測部門及田間檢測,本研究結果將為轉基因大豆的田間監控及轉基因食品的安全檢測提供有力的技術支持。

1 材料與方法

本試驗于2012年11月至2013年12月在中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室完成。

1.1 供試大豆品種

抗草甘膦轉基因大豆品種‘AG5601’、‘中作1’、‘中作2’以及常規大豆品種‘中黃13’、‘中黃30’和‘SNK500’為本實驗室保存;常規大豆品種‘抗線9’、‘黑農44’、‘黑農48’、‘黑農64’、‘黑農66’,‘黑農68’和‘黑農69’由黑龍江省農科院饋贈。

1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、DNA marker DL 2000購自寶生物工程(大連)有限公司;Bst DNA 聚合酶大片段購自美國New England Biolabs公司; SYBR Green I 購自美國Invitrogen公司;植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305)購自天根生化(北京)科技有限公司。

1.3 大豆基因組DNA 提取

大豆葉片基因組 DNA 提取采用DNAsecure Plant Kit完成。采用紫外分光光度儀Nanodrop 2000(Themo,美國)測定DNA濃度,置于-20 ℃保存。

1.4 LAMP 引物設計

根據Cp4-epsps基因序列(GenBank登錄號:I43998),使用在線軟件PrimerExplorer Version 4.0 (http:∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計LAMP 引物,包含2條外引物(F3和 B3)、2條內引物(FIP 和 BIP)以及2條環引物(LB和LF)(表1,圖1)。所有的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 試驗所用引物序列

圖1 抗草甘膦轉基因大豆LAMP 引物設計Fig.1 LAMP primer design for detection of glyphosate-resistant soybean

1.5 LAMP 體系的建立

參照Fukuta等[24]設定LAMP 反應的初始體系,對反應中的關鍵因子dNTPs、Mg2+濃度、反應溫度及時間進行優化。

反應體系包括內引物FIP和BIP各1.6 μmol/L,外引物F3和B3各0.2 μmol/L,環引物LB和LF各0.4 μmol/L,dNTPs (0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol/L),Mg2+(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L),20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,8 U Bst DNA聚合酶大片段,1 μL模板DNA,ddH2O補齊至25 μL。將上述反應體系混勻后,置于60～65 ℃保溫15～90 min,85 ℃酶滅活5 min。LAMP 擴增結束后,加2 μL 100×SYBR Green I 核酸染料,混勻后觀察顏色變化。同時取2 μL擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色后,在凝膠成像系統(Biorad DX)中觀察照相。

1.6 常規PCR檢測

常規PCR 反應采用一步雙重PCR,其中內標基因lectin和Cp4-epsps檢測引物和擴增體系參照中華人民共和國農業行業標準NY/T675-2003 《轉基因植物及其產品檢測大豆定性PCR方法》進行,擴增體系包括2.5 μL 10×buffer(含有Mg2+), 2 μL dNTPs (10 mmol/L), 引物Lectin F、Lectin R、Cp4-epsps F和Cp4-epsps R(表1)各1 μL,0.5 μLTaq酶和1 μL模板DNA,ddH2O 補齊至25 μL。擴增程序為： 95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃,10 min; 4 ℃保存。取5 μL擴增產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色后觀察并照相。

1.7 特異性分析

以轉基因品種‘AG5601’、‘中作1’、‘中作2’，以及非轉基因品種‘SNK500’、‘中黃13’、‘中黃30’、‘抗線9’、‘黑農44’、‘黑農48’、‘黑農64’、‘黑農66’、‘黑農68’、‘黑農69’基因組DNA為模板同時進行LAMP 和常規PCR檢測，反應體系及條件參照1.5和1.6,以驗證所設計的LAMP 引物的特異性。

1.8 靈敏度分析

將5×104μg/L抗草甘膦轉基因大豆‘AG5601’的基因組DNA按照10倍梯度稀釋成7個濃度梯度(5×104、5×103、5×102、5×101、5、5×10-1、5×10-2μg/L),各取1 μL作為模板,按照1.5優化的體系進行LAMP 檢測,同時進行常規PCR擴增,比較兩種檢測方法的靈敏度。

1.9 田間大豆樣品的 LAMP 檢測

在中國農業科學院廊坊科研中試基地轉基因大豆生物安全性評價試驗地,大豆3～4片復葉期間,隨機選取45個大豆品種(表2),每個品種采集2～3片葉子, 提取DNA作為模板,采用1.5 優化的LAMP 體系進行擴增,以轉基因大豆‘AG5601’為陽性對照。同時,以上述模板進行一步雙重PCR檢測,比較分析LAMP 檢測與PCR 準確性。

2 結果與分析

2.1 LAMP 擴增反應體系優化

dNTPs 濃度優化結果表明,當dNTPs濃度為0.4 mmol/L時無擴增,在dNTPs濃度為0.8～2.4 mmol/L時均有擴增,但擴增效率無明顯差異(圖2a);Mg2+濃度優化結果表明,在1～3 mmol/L 時,隨著Mg2+濃度的增加,擴增效率增加,但當Mg2+濃度超過3 mmol/L 時,擴增效率下降(圖2b),因此確定最適Mg2+濃度為3 mmol/L;溫度優化結果表明,在60～65 ℃ 之間進行擴增時,擴增效果無明顯差異(圖2c);加環引物的LAMP 擴增時間優化結果表明(圖2d),在15～30 min,沒有擴增,45 min開始出現擴增,隨著時間增加,擴增結果無顯著差異,由此確定加環引物的LAMP 擴增最佳時間為45 min。不加環引物的LAMP 擴增時間優化結果(圖2e)表明,擴增75 min時才有微弱的條帶，在90 min出現明顯的擴增條帶，因此不加環引物的LAMP 擴增最佳時間為90 min，這說明加環引物可以將反應時間縮短到一半。由此確定LAMP 優化的擴增體系為：dNTPs濃度0.8 mmol/L,Mg2+濃度3 mmol/L,添加環引物LB和LF,其他擴增條件不變,60 ℃擴增45 min。

圖2 抗草甘膦轉基因大豆LAMP 反應條件的優化Fig.2 Optimization of condition for LAMP reaction

2.2 特異性分析

以3種抗草甘膦轉基因大豆和10種非轉基因大豆的基因組DNA為模板進行LAMP 擴增,檢測LAMP 擴增引物的特異性。SYBR Green I染色結果表明,3種轉基因大豆‘中作1’、‘中作2’和‘AG5601’ LAMP 擴增產物中觀察到綠色熒光信號,而10種非轉基因大豆品種的LAMP 擴增結果為橙色(圖3a)。凝膠電泳檢測結果表明,3個轉基因大豆的擴增產物均觀察到特征性的梯形條帶,而非轉基因大豆無任何擴增產物(圖3b)。常規PCR檢測結果表明,3種轉基因大豆均擴增得到500 bp左右的Cp4-epsps特異條帶,所有樣品均檢測到長度為118 bp的lectin內標基因的條帶(圖3c),大小約為118 bp。LAMP 擴增結果與PCR檢測結果一致。

圖3 抗草甘膦大豆品種LAMP 特異性分析結果Fig.3 The specificity for detection of glyphosate-resistant soybean varieties by LAMP

2.3 靈敏度分析

靈敏度分析結果表明,抗草甘膦轉基因大豆基因組DNA濃度稀釋到5 μg/L時,仍能檢測到LAMP 擴增產物,繼續將DNA濃度稀釋到5×10-1μg/L時,檢測不到擴增產物(圖4a、b);常規PCR擴增結果顯示,當模板DNA濃度稀釋到5×102μg/L時,可以檢測到目的條帶,再次稀釋則檢測不到(圖4c)。由此得出LAMP 的檢測最低濃度為5 μg/L,約為4拷貝(1 ng基因組DNA的拷貝數為877),PCR的檢測最低閾值為5×102μg/L,約為400拷貝,由此確定LAMP 的檢測靈敏度為常規PCR的100倍。

2.4 田間大豆樣品的LAMP 檢測

45個田間樣本LAMP 檢測結果顯示,其中24個品種染色結果為綠色。常規PCR也從上述24個品種中擴增出500 bp左右以及118 bp 2條目的條帶,其他品種均只在118 bp處出現1條目的條帶。LAMP 檢測結果與PCR檢測結果完全一致,檢測精確率為100 %(表2)。

圖4 抗草甘膦大豆LAMP 檢測和PCR 檢測靈敏度分析結果Fig.4 The sensitivity for detection of glyphosate-resistant soybean by LAMP and PCR

3 討論與結論

根據抗草甘膦轉基因大豆的外源Cp4-epsps基因設計一組特異性LAMP 引物,并對反應中的關鍵因素進行一系列優化,建立了一種高靈敏度和高特異性的抗草甘膦轉基因大豆LAMP 快速檢測方法。研究結果表明,抗草甘膦大豆Cp4-epsps基因的LAMP 檢測體系中最佳dNTPs濃度為0.8 mmol/L,這與陳金松等[15]建立的抗草甘膦轉基因玉米CaMV35S的LAMP 檢測優化體系一致,而本研究的最佳Mg2+濃度為3 mmol/L, 與陳金松等建立的最優體系Mg2+濃度4 mmol/L具有一定的差異,這可能是由于靶基因不同或者是引物的差異所致。靈敏度檢測結果表明,本研究建立的LAMP 檢測體系最低DNA檢測濃度為4拷貝,檢測靈敏度比轉基因棉花的LAMP 檢測靈敏度 40拷貝[18]要高8倍,而和抗草甘膦轉基因大豆(RR大豆)LAMP 檢測靈敏度5拷貝[25]基本一致。

為了加快反應速度,本研究在4條LAMP 特異引物的基礎上,增加了一對環引物,擴增時間縮短至45 min,相較于常規PCR 擴增和一般LAMP 擴增相比,時間縮短一半以上。和Real-time PCR相比,LAMP 檢測不需要PCR 儀等專業儀器設備,操作便捷,且通過添加SYBR Green I等熒光染料,結果肉眼即可判斷,能夠用于試驗條件較差的基層檢測和現場快速檢測。

在本研究的田間實際檢測中,45個田間樣本多數為轉基因抗草甘膦大豆和普通大豆或者野生豆雜交后代,而LAMP 檢測均能夠準確地鑒定,說明建立的抗草甘膦轉基因大豆LAMP 檢測方法不僅可以應用到轉基因大豆樣品的檢測中,還可以應用到田間雜交樣品的實際檢測中。本研究方法在田間轉基因大豆的快速篩選中具有廣泛的應用前景。

由于LAMP 擴增的靈敏度較高,更容易受到氣溶膠的污染而出現假陽性結果。本研究為了降低氣溶膠污染,在LAMP 反應體系中滴加1滴石蠟油,這樣可以在反應完成后將反應產物密封在管內,有效減少氣溶膠的產生。

綜上所述,本研究建立的抗草甘膦轉基因大豆Cp4-epsps基因LAMP 檢測方法, 具有快速高效、特異性好、靈敏度高、操作便捷等優勢,特別適用于基層檢測及田間檢測,是抗草甘膦轉基因大豆風險評估及轉基因食品安全檢測的一個有力工具。

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(責任編輯：楊明麗)

Rapid and simple detection ofCp4-epspsgene in glyphosate-resistant soybean by loop-mediated isothermal amplification

Zhu Linfeng, Peng Huan, Huang Wenkun, Zhang Dongsheng, Kong Ling’an, Peng Deliang

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,China)

The LAMP (loop-mediated isothermal amplification) assay based glyphosate-resistant soybean detection system was developed in this paper. A set of four basic primers and two loop primers was designed to target the exogenousCp4-epspsgene. The LAMP products were detected by agarose gel electrophoresis and SYBR Green I. The optimum result was obtained at 45 min of reaction time, 0.8 mmol/L dNTPs and 3 mmol/L Mg2+.The method developed in this paper could specifically detect glyphosate-resistant soybeans.And the low detect limit of genomic DNA of glyphosate-resistant soybeans was 5 μg/L which was 100 times higher than that of regular PCR. The field testing showed that the results of LAMP detection were consistent with those of PCR, and the accuracy of this method was 100%. The LAMP method we developed for glyphosate-resistant soybean detection is rapid,efficient, specific，sensitive and convenient，which make it a useful tool for detection of glyphosate-resistant soybean, monitoring of gene flow and research on environmental security.

glyphosate-resistant soybean;Cp4-epsps; LAMP; rapid and simple detection

2014-04-11

2014-06-25

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX008011-003)

S 565.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.017

* 通信作者 E-mail：pengdeliang@caas.cn