木霉Tr-92菌株厚垣孢子發酵條件的優化

張晶晶, 黃亞麗, 馬 宏, 賈振華, 史延茂, 宋水山

(1. 河北省科學院生物研究所, 河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心, 石家莊 050081;2. 河北工業大學化工學院, 天津 300130)

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木霉Tr-92菌株厚垣孢子發酵條件的優化

張晶晶1,2, 黃亞麗1*, 馬 宏1, 賈振華1, 史延茂1, 宋水山1*

(1. 河北省科學院生物研究所, 河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心, 石家莊 050081;2. 河北工業大學化工學院, 天津 300130)

利用單因素試驗、正交試驗方法對木霉Tr-92厚垣孢子發酵培養基及培養條件進行優化,篩選獲得了適合此菌株厚垣孢子產生的最佳培養基組成為：草炭2.5%,玉米漿4.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.5%;最佳培養條件為：接種量3%,裝液量75 mL/250 mL,轉速為180 r/min,初始pH 5.0,溫度28 ℃,培養時間7 d。在此培養條件下,木霉Tr-92菌株厚垣孢子產量達到3.01×108個/mL。與優化前相比,厚垣孢子產量增長130.80%。通過培養條件優化確定了適合木霉Tr-92菌株產生厚垣孢子的條件,為高效木霉厚垣孢子生防菌劑的研制奠定了基礎。

木霉; 厚垣孢子; 液體發酵; 培養基; 發酵條件

木霉(Trichoderma)是一種具有重要經濟價值的生防真菌,自1932年Weindling首次發現木素木霉(Trichodermalignorum)可以寄生于多種植物病原真菌后[1],經多年研究發現木霉菌對18個屬的29種病原菌具有拮抗作用[2],其生防機制包括競爭作用[3]、抗生作用[4]、重寄生作用[5]和誘導抗性[6]等,成功研制出了50多種木霉制劑[7],其中以美國的Topshield(哈茨木霉T22)[8]和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)[9]應用最為廣泛。

商品化的木霉制劑大多為分生孢子制劑或分生孢子和菌絲的混合制劑,由于分生孢子自身的特點造成木霉分生孢子制劑保質期短、田間防效穩定性差。厚垣孢子是木霉在逆境情況下產生的一種繁殖體,該類孢子在儲存、萌發及在逆境情況下的存活能力均遠遠優于分生孢子[10],因此,為了提高木霉制劑的田間施用效果,進行木霉厚垣孢子制劑的研制非常必要。然而,與分生孢子相比,木霉厚垣孢子的培養條件較為苛刻,培養時間長且厚垣孢子產生量少,這增加了木霉厚垣孢子制劑的成本、限制了厚垣孢子制劑的開發,所以,亟須進行高產厚垣孢子的發酵條件研究。

木霉Tr-92是由本課題組自植物根際土壤中分離和鑒定的一株拮抗木霉,初步研究發現該菌對灰霉病菌、立枯絲核菌、鐮刀菌等十余種病原菌均具有較強的拮抗作用[6,11],對灰霉菌生長的抑制作用達75.2%;顯微鏡觀察拮抗平板發現,木霉Tr-92的菌絲通過纏繞、穿透、緊貼等方式寄生在病原菌的菌絲之上。研究還發現,將該菌株的分生孢子懸液施用于黃瓜根部,可以誘導黃瓜葉部對灰霉病菌的系統抗性,防病效果達到56%[6,11];這些研究表明該菌株能夠通過土壤施用來防治土傳和葉面病害,是一株具有良好生防潛力的菌株。本研究對木霉Tr-92液體發酵產厚垣孢子的培養條件進行篩選和優化,以期提高該菌株的厚垣孢子產量,降低成本,為厚垣孢子制劑的開發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

木霉Tr-92菌株,為本實驗室篩選、保存并鑒定。

1.1.2 培養基

(1)燕麥粉培養基：燕麥粉(30目)50 g,加水至1 L;(2)玉米粉培養基[12]：玉米粉(30目)50 g,加水至1 L;(3)草炭+玉米漿培養基：草炭5%,玉米漿3%,葡萄糖2%,酵母膏0.5%,加水至1 L;(4)玉米+大豆培養基：大豆粉(30目)20 g,玉米粉(30目)10 g,加水至1 L;(5) 大豆培養基：大豆粉(30目)20 g,加水至1 L;(6)Gorodkowa培養基[13]：氯化鈉5 g,蛋白胨10 g,葡萄糖2.5 g,牛肉膏10 g,加水至1 L,pH6.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉Tr-92的培養及分生孢子懸液的制備

將試管保存的木霉Tr-92菌種接種到PDA平板上,30 ℃恒溫培養5 d,用無菌水沖洗木霉Tr-92平板得到木霉孢子液,充分混勻后用血球計數板計數,并調整其濃度為1×106cfu/mL。

1.2.2 不同培養基對厚垣孢子產量的影響

按照1.1.2中培養基配方進行6種培養基的配制,250 mL三角瓶裝液量為50 mL,121 ℃滅菌20 min。按1%的接種量將木霉孢子懸液接種到相應的培養基中,28 ℃、200 r/min恒溫搖床培養,每24 h用顯微鏡觀察不同培養基中木霉的生長狀況。待厚垣孢子基本脫落后,吸取1 mL孢子液稀釋合適倍數后用血球計數板計數并計算各處理的厚垣孢子濃度。每個處理重復3次。以下各項試驗除了已篩出的最佳條件和所測項目外,均與此相同。

1.2.3 草炭+玉米漿培養基成分的正交優化

以產厚垣孢子最好的(3)草炭+玉米漿培養基為基礎培養基,通過正交試驗進一步優化培養基的配方。選用3因素3水平的L9(33)正交表進行試驗,正交試驗因素及水平見表1,共安排9個試驗組,每個試驗組3個重復。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 木霉Tr-92產厚垣孢子培養條件的優化

(1)初始pH對木霉厚垣孢子產生的影響：以優化培養基為基礎培養基,用HCl和NaOH溶液調節培養基的初始pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10進行木霉培養,測定不同處理中厚垣孢子的數量,每處理3次重復。

(2)溫度對木霉厚垣孢子產生的影響：以優化培養基為基礎培養基,分別在20、24、28、32 ℃和36 ℃等溫度下進行振蕩培養,測定不同溫度處理下厚垣孢子的數量,每處理3次重復。

(3)接種量對木霉厚垣孢子產生的影響：用250 mL三角瓶,每瓶裝50 mL優化培養基,分別按1%、3%、5%、7%、9%的接種量進行振蕩培養8 d,測定不同接種量處理中厚垣孢子的數量,每處理3次重復。

(4)裝液量對木霉厚垣孢子產生的影響：用250 mL三角瓶,按裝液量25、50、75、100、125 mL裝入優化培養基,恒溫搖床振蕩培養8 d,測定不同裝液量處理中厚垣孢子的數量,每處理3次重復。

(5)培養時間對木霉厚垣孢子產生的影響：用250 mL三角瓶,按最優發酵條件進行恒溫搖床振蕩培養,每天用顯微鏡觀察厚垣孢子的分化情況,測定不同培養時間處理中厚垣孢子的數量,每處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 木霉Tr-92在不同培養基中產生厚垣孢子的情況

試驗結果(圖1)表明,供試的6種培養基,除Gorodkowa培養基外,其他5種培養基培養Tr-92均能產生厚垣孢子,其中以草炭+玉米漿培養基中厚垣孢子產量最多,且基本上不產生分生孢子,在玉米培養基和燕麥培養基中則同時產生大量厚垣孢子和分生孢子,玉米+大豆粉培養基和大豆粉培養基產生的厚垣孢子相對較少。因此,初步確定草炭+玉米漿培養基為適合木霉Tr-92產厚垣孢子的基礎培養基。

2.2 草炭+玉米漿培養基成分的正交優化

以Ki值最優的水平為試驗的最佳條件,由表2可知,Tr-92最適發酵組合為A3(4.5%)B1(2.5%)C2(2%),即該菌的最佳培養基配方為草炭2.5%、玉米漿4.5%、葡萄糖2%。其中,以草炭的含量對厚垣孢子產生數量的影響最大,其次是葡萄糖,玉米漿的影響最小。

圖1 不同培養基對木霉Tr-92產厚垣孢子的影響Fig.1 Effects of different media on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

試驗號No.A(玉米漿含量)/%MaizesteepliquorB(草炭含量)/%PeatC(葡萄糖含量)/%Glucose厚垣孢子數/×108個·mL-1No.ofchlamydospores1A1(1.5)B1(2.5)C1(1)0.022A1(1.5)B2(5.0)C2(2)0.233A1(1.5)B3(7.5)C3(3)0.044A2(3.0)B1(2.5)C2(2)1.245A2(3.0)B2(5.0)C3(3)0.396A2(3.0)B3(7.5)C1(1)0.017A3(4.5)B1(2.5)C3(3)1.268A3(4.5)B2(5.0)C1(1)0.119A3(4.5)B3(7.5)C2(2)0.48K10.292.520.14K21.640.731.95K31.850.531.69k10.100.840.05k20.550.240.65k30.620.180.56R1.561.991.81

2.3 木霉Tr-92厚垣孢子發酵條件的優化

2.3.1 初始pH對木霉Tr-92厚垣孢子產量的影響

培養8 d后測定木霉Tr-92菌株在不同初始pH的培養基中產生厚垣孢子的情況,結果表明(圖2),初始pH為5時的厚垣孢子產量最大,達到1.89×108個/mL;初始pH為4、5、6、7時厚垣孢子產生量差異不大;而從pH 7開始,隨著pH增加,Tr-92產生的厚垣孢子數量急劇下降,pH為10時厚垣孢子產量最低,僅為0.18×108個/mL,說明偏酸的環境適合木霉厚垣孢子產生。

圖2 不同初始pH對木霉Tr-92產厚垣孢子的影響Fig.2 Effects of initial pH on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

試驗過程中也檢測了分生孢子的產生情況,結果顯示在不同的pH下,分生孢子的產生情況也不同。在pH 3～10處理中均發現分生孢子的產生,并在pH 10時達到最大值,在pH 3～7的培養基中分生孢子量很少。因此可以通過初始pH的調控,有目的地調控厚垣孢子或分生孢子的產生。

2.3.2 培養溫度對木霉Tr-92厚垣孢子產量的影響

溫度也是影響木霉厚垣孢子產生的重要因素(圖3),木霉Tr-92在5個試驗溫度下均能產生厚垣孢子,其中以28 ℃產生厚垣孢子的數量最大,為2.03×108個/mL;在高于32 ℃培養時木霉菌株生長緩慢,菌絲細弱,培養液內菌絲結團,產厚垣孢子量相對較少,36 ℃時則僅有少量厚垣孢子產生。

圖3 不同溫度對木霉Tr-92產厚垣孢子的影響Fig.3 Effects of temperature on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.3 接種量對木霉Tr-92厚垣孢子產量的影響

不同接種量對木霉厚垣孢子產量的影響相對較小,在接種量為3%時厚垣孢子產量最多,接種量大于3%時各處理的厚垣孢子數量差異不大。接種量大時,厚垣孢子產量略有下降。

圖4 不同接種量對木霉Tr-92產厚垣孢子的影響Fig.4 Effects of inoculum size on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.4 裝液量對木霉Tr-92厚垣孢子產量的影響

不同的裝液量影響微生物培養過程中氧的供應量,在250 mL三角瓶中裝入25、50、75、100、125 mL培養基進行搖床培養,在裝液量為75 mL時厚垣孢子產量達到最大,厚垣孢子數量為2.78×108個/mL,其次是裝液量為50 mL時厚垣孢子產量為2.09×108個/mL,在裝液量為125 mL時,厚垣孢子產量最低僅為0.98×108個/mL。說明裝液量過多時,由于溶解氧降低造成厚垣孢子產生能力的下降。

圖5 不同裝液量對木霉Tr-92產厚垣孢子的影響Fig.5 Effects of medium volume on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.5 最適發酵條件下木霉Tr-92厚垣孢子的產生情況

選取初始pH、溫度、接種量、裝液量4個因素的最優值,進行木霉Tr-92的培養。鏡檢結果發現,培養時間在1～3 d時,木霉主要進行菌絲的生長,培養基逐漸變稠;培養時間在3～6 d時,厚垣孢子開始產生,數量緩慢增加;培養時間在6～7 d時,厚垣孢子大量形成并脫落;血球計數板計數發現,培養7 d時厚垣孢子產生數量達到最大值3.01×108個/mL。與優化前相比,厚垣孢子產量增長130.80%;7 d之后,厚垣孢子數量逐漸減少(見圖6)。

圖6 最優發酵條件下木霉Tr-92產厚垣孢子的情況Fig.6 The Production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores under optimal fermentation conditions

3 討論

隨著對化學農藥危害的認識,生物防治將成為控制植物病害的重要措施。木霉作為一種重要的生防真菌在農作物病害生物防治過程中起著重要的作用,但木霉分生孢子制劑在田間穩定性和保質期方面還存在著一些問題,因此亟須開發具有良好生防效果的厚垣孢子制劑,以提高木霉的生防價值。

本研究以具有良好生防效果的木霉Tr-92菌株為試驗材料,進行該菌株厚垣孢子液體發酵條件的研究,發現在不同的培養基中該菌株產生厚垣孢子的能力不同,其中以在草炭+玉米漿培養基中的厚垣孢子產量最大,其次為燕麥粉培養基。鄒勇[14]的研究表明,黃綠木霉T-33在燕麥培養基中也能產生大量的厚垣孢子。秦蕓等[13]采用Gorodkowa培養基培養哈瑞木霉產生大量厚垣孢子,但用該培養基培養哈茨木霉Tr-92時則完全不產生厚垣孢子,說明木霉菌的種或菌株不同產厚垣孢子的最適培養基也存在差異,有必要針對不同的菌株進行厚垣孢子產孢條件的優化。

初步篩選出適宜木霉Tr-92產生厚垣孢子的培養基后,本研究采用正交試驗方法對培養基組分進行了進一步優化,試驗發現,培養基3個組分對厚垣孢子產生量影響大小依次為：草炭、葡萄糖和玉米漿,確定最優的發酵培養基為草炭2.5%、葡萄糖2%、玉米漿4.5%、酵母膏0.5%。

在培養條件優化過程中發現培養溫度、初始pH和裝液量對木霉Tr-92產厚垣孢子量的影響較大,當溫度為28 ℃、初始pH為5、裝液量為75 mL/250 mL時厚垣孢子產量最高;在250 mL三角瓶內,相同的接種量下,裝液量過多,則養分過量、溶解氧較少,造成木霉菌絲大量產生,從而使厚垣孢子分化較慢、產量較低;裝液量過少,則木霉菌絲生長不夠豐富,產生厚垣孢子的時間提前,但產生量相對較少,李峰[15]的研究也取得了相似的結果。真菌喜好偏酸的生長環境,本研究發現木霉Tr-92產厚垣孢子的最適初始pH為5,其中pH 4～7之間厚垣孢子產量相差不多,說明該菌株產厚垣孢子的最適條件也為中性偏酸的環境,與莊敬華[16],顧金剛[17]等的研究結果相似,而武為平等[18]的研究表明,棘孢木霉的最適產厚垣孢子的pH僅為3,表明不同菌株的最適產孢條件存在差異。微生物的生長繁殖對溫度有著嚴格的要求,本試驗結果顯示,木霉Tr-92產生厚垣孢子的溫度范圍在24～32 ℃,培養溫度過低或過高都會抑制厚垣孢子的分化。通過顯微鏡觀察發現,厚垣孢子產生量高時則分生孢子產生量較低,反之依然,這說明木霉厚垣孢子和分生孢子產生有不同的調控途徑。通過優化,木霉Tr-92在發酵時間為7 d時厚垣孢子產量達到3.01×108個/mL,有效地提高了木霉厚垣孢子產生效率。該研究結果為木霉厚垣孢子制劑的開發奠定了基礎,對木霉制劑的進一步推廣應用具有重要的意義。

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(責任編輯：田 喆)

Optimization of liquid fermentation conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores

Zhang Jingjing1,2, Huang Yali1, Ma Hong1, Jia Zhenhua1, Shi Yanmao1, Song Shuishan1

(1.Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Diseases, Shijiazhuang 050081, China; 2. School of Chemical Engineering and Technology, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China)

The optimal liquid fermentation conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores were investigated by single factor test and orthogonal test. The results indicated that the optimal conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores were as followed: 2.5% peat, 4.5% maize steep liquor, 2% glucose, 0.5% yeast extract, 3% inoculum, 180 r/min, 28 ℃, initial pH 5.0, and 75 mL liquid medium per 250 mL flask. The actual yield of chlamydospores was 3.01×108spores/mL after 7 days. The chlamydospore production increased by 130.80% compared with the control.

Trichoderma; chlamydospores; fermentation in liquid; culture medium; fermentation condition

2014-04-18

2014-08-14

河北省自然科學基金(C2010001565)；河北省省級科技計劃專項工作類項目(13256504D)

Q 949.2, S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.005

* 通信作者 E-mail:huangyali2291@163.com；shuishans@hotmail.com