連續施用發酵豬糞對土壤中四環素抗性基因數量的影響

彭 雙，王一明，林先貴*（1.中國科學院南京土壤研究所，土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，江蘇 南京 210008；2.中國科學院南京土壤研究所-香港浸會大學土壤與環境聯合開放實驗室，江蘇 南京 210008）

連續施用發酵豬糞對土壤中四環素抗性基因數量的影響

彭 雙1，2，王一明1，2，林先貴1，2*（1.中國科學院南京土壤研究所，土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，江蘇 南京 210008；2.中國科學院南京土壤研究所-香港浸會大學土壤與環境聯合開放實驗室，江蘇 南京 210008）

為了研究連續施用發酵豬糞之后，土壤中抗性基因的數量以及發酵豬糞的施用量對土壤抗性基因的影響，采用實時熒光定量PCR方法，對稻麥輪作模式下連續6年施用4.5t/hm2和9.0t/hm2發酵豬糞的土壤進行了四環素抗性基因（TRGs）的檢測和定量分析.在施用發酵豬糞的土壤中能夠檢測到9種TRGs.施用發酵豬糞顯著增加了土壤中tetG、tetL、tetB（P）、tetO、tetW的絕對數量，其中tetB（P）、tetW、tetO的絕對數量受到了施肥用量的影響；而tetZ、tetC和tetS的絕對數量則沒有受到施肥的影響.上述8種TRGs在同一施肥處理的0～5cm、5～10cm以及10～20cm土壤中的相對豐度分布均無顯著差異.發酵豬糞的施用也顯著增加了tetG、tetL、tetB（P）和tetO的相對豐度，但是僅有tetO的相對豐度受到了施肥用量的顯著影響.本研究表明，在稻麥輪作模式下，農田土壤中的TRGs數量會受到發酵豬糞中殘留TRGs的影響，連續施用該糞肥會顯著增加土壤中tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數量和相對豐度.因此，需要優化畜禽糞堆肥發酵工藝，以減少抗性基因在糞肥中的殘留.

四環素抗性基因；糞肥農用；基因污染；耐藥性

近年來，由于濫用抗生素而導致大量耐藥性致病菌的出現引起了人們對抗生素及抗生素抗性基因（ARGs）擴散的廣泛關注.ARGs在環境中的持久性殘留，以及在不同環境介質中的傳播、擴散可能比抗生素本身的環境危害更大［1］.越來越多的證據表明水產養殖、動物飼養、農業施肥以及生活污水處理等人類活動促進了抗生素抗性在環境中的傳播［2］.畜禽糞便中含有高水平的抗生素［3-4］、抗生素抗性微生物［5-7］、重金屬（與抗性基因之間有協同選擇作用）［8-9］和抗性基因［3，6-8］，其資源化利用過程中對環境造成的影響是目前越來越受關注的問題.

土壤是人類病原菌抗性基因的主要來源［10］，也是畜禽糞便消納的主要場所.因此，畜禽糞污染或者施用到土壤后對土壤抗性菌和抗性基因的影響也是當前抗性擴散研究的熱點之一.一些研究者從不同的角度研究了畜禽糞肥施用對土壤抗性的影響.如Sengel?v等［11］發現土壤細菌的四環素抗性水平可以在短期內因豬糞漿的施加而上升，而且可以隨著豬糞漿施用量的增加而增加. Byrne-Bailey等［12］的研究結果表明施用豬糞會顯著增加土壤中可培養微生物對四環素和磺胺類抗生素的抗性水平，施用豬糞漿是影響土壤中四環素及磺胺類抗性基因豐度的重要因素［13］.

為了減少新鮮畜禽糞便中的有害物質對環境的污染，工廠化堆肥發酵有機肥具有很大的應用前景.研究表明，堆肥能夠顯著降低糞肥中殘留抗生素的濃度［14-16］，并且能夠降低其中的抗性基因含量［17-19］，是減少糞肥污染的一種方式［20-21］.目前，畜禽糞便發酵有機肥的施用越來越廣泛，但是關于畜禽發酵有機肥中殘留抗性基因的在土壤中的留存和污染能力；連續施用有機肥之后，農田土壤中抗性基因的豐度；以及有機肥的施用量對土壤抗性基因的影響卻鮮有研究.

四環素類抗生素是目前使用最為廣泛的一種抗生素，自1953年發現第一個四環素抗性基因（TRGs）以來，陸續發現的TRGs已達40多種［22］.跟多數抗性基因類似，TRGs一般通過5種方式起作用:編碼抗生素外排泵、編碼核糖體保護蛋白、編碼抗生素鈍化/降解酶、降低藥物的滲透性和靶向修飾.其中前2種是TRGs最主要的作用方式.目前，超過22種TRGs已經在不同的環境樣品中被檢測到［23］.但是已有的研究多集中于養殖場周邊污染土壤以及新鮮或簡單漚制/儲存的糞便施用后的土壤，缺乏對于連續施用發酵糞肥后土壤中TRGs的定位觀測和研究.此外，稻麥輪作是江蘇省主要的農作模式，而有關該模式下水稻土壤中TRGs的研究僅有零星報道.因此，本研究以中國科學院常熟農業生態實驗站長期定位施用發酵豬糞試驗地為平臺，靶標在不同環境中被多次報道的23種TRGs，以期揭示在稻麥輪作模式下水稻土壤中的TRGs數量，以及連續施用不同重量的發酵豬糞對土壤TRGs的影響，為有機肥的生態施用提供依據，并為進一步研究稻麥輪作模式下糞肥施用對土壤TRGs的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試發酵豬糞及施肥處理

供試的發酵豬糞（CM）來自江蘇常熟的某規?；B豬場附近的有機肥廠，該有機肥廠以養豬場豬糞為原料，經過工廠化條垛式堆肥發酵制成商品有機肥（即發酵豬糞），該廠年產量3000～5000t.自2006年開始，在中國科學院常熟農業生態實驗站的8塊試驗田（30m2）分別進行施肥處理，該試驗田自實驗站成立（1987年）以來無糞肥施用歷史.采用稻麥輪作的耕作方式，在稻麥插秧/播種前施肥，其中4塊試驗田每季施用的發酵豬糞量為4.5t（干重）/hm2（記為LC），其余4塊施用9.0t（干重）/hm2的發酵豬糞（記為HC），并以實驗站內不施肥的4塊空地作為對照（記為CK）.本實驗區土壤類型俗稱為烏柵土，中國土壤系統分類為潛育水耕人為土.發酵豬糞的基本性質為pH 6.69、有機質含量42.77%、全氮1.43%、全磷（P2O5）3.67%、全鉀（K2O）1.52%.土壤的基本性質為pH 7.48、有機質含量41.8g/kg、全氮1.9g/kg、全磷（P2O5） 2.7g/kg、全鉀（K2O） 21.4g/kg.

1.2 土樣的采集和保存

在2011年稻季末（施肥第6年），用直徑2cm的土鉆在各個試驗田（HC、LC、CK）分別打6個孔，采集0～20cm土層的土壤樣品，將所取土樣分0～5cm、5～10cm以及10～20cm三層收集，挑出殘留的植物根系和石塊并混合均勻，4℃條件下帶回實驗室，-40℃冷凍保存待測.

1.3 發酵豬糞TRGs的檢測和鑒定

取-40℃保存的2011年插秧前施用的發酵豬糞樣品，提取總DNA，提取方法參照FastDNA?SPIN Kit for Faces （MP Biomedicals， Santa Ana，CA）試劑盒，用核酸蛋白質分析儀NanoDrop ND-1000 （NanoDrop Technologies， Wilmington，DE）測定DNA濃度，-20℃保存待測.

用PCR方法對發酵豬糞中的TRGs進行檢測，tet（B（P）、M、O、Q、S、T、W）和otrA所用的引物和PCR程序參考Aminov等［24］，tet（A、B、C、D、E、H、J、Y、Z、30）參考Aminov等［25］，tet（G、X、K）參考Ng等［26］，tetU和tetL分別參考Perreten等［27］和You等［28］.25μL的PCR體系中包括12.5μL的Premix EX TaqTMmixture （TaKaRa），2pmol的上下游引物，和大約150ng的模版DNA. 用2% （w/v）的瓊脂糖凝膠在1× TAE的電泳緩沖液中分析PCR產物，重復3次，以無菌蒸餾水為陰性對照.

將發酵豬糞中檢測到的TRGs PCR產物純化，并連接到pEASY-T3 （TransGen Biotech，Beijing）載體上，轉化感受態細胞（詳細克隆步驟參見試劑盒說明書），通過藍白斑篩選隨機挑取6～8個轉化子，用M13引物驗證陽性，并將陽性轉化子保存于含有0.1g/L氨芐青霉素的LB培養液中（將培養液與滅菌的80%甘油混合后在-20℃冷凍保存）.取3個陽性轉化子送交華大基因測序.將測得的序列提交到NCBI GenBank比對，確定所得的序列為目標基因序列.

1.4 土壤DNA的提取和TRGs的檢測

取0.5g保存的土樣提取土壤DNA，提取方法參照FastDNA?SPIN Kit for soil試劑盒，測定DNA濃度，-20℃保存.檢測土壤中的TRGs，檢測方法同1.3，以1.3中的陽性轉化子質粒為陽性對照，無菌水為陰性對照.

1.5 TRGs的定量PCR（qPCR）分析

用E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit I（OMEGA，USA）試劑盒提取1.3中保存的陽性轉化子質粒，并測定質粒的濃度以及純度，參考Zhang等［29］計算質?？截悢?將質粒進行10倍的梯度稀釋，用來制作qPCR標準曲線.用SYBR?Premix Ex TaqTMKit （TaKaRa）進行樣品分析，20μL反應體系中含有10μL SYBR?Premix Ex TaqTM，0.5μM引物，1.0μL模版DNA（2～9ng DNA），以無菌水作為空白對照.每個樣品3個重復，瓊脂糖凝膠檢測擴增的條帶為目的條帶并且熔解曲線僅有1個峰.擴增效率范圍為95.4%～102%，R2值為0.990～1.000.根據土壤的質量和含水量計算TRGs的絕對數量（copy/g干土）.同時對細菌16S rRNA基因進行定量，并計算TRGs與16S rRNA基因的比值（相對豐度），16S rRNA基因的定量方法參考Biddle等［30］.

1.6 試驗數據分析

所得數據用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0進行統計分析，并使用Duncan檢驗進行顯著性分析（P＜0.05），圖由軟件Origin 8.6繪制.

2 結果與討論

2.1 土壤中TRGs的檢測

因為HC處理施用的發酵豬糞量較高，推測該處理的土壤中可通過PCR方法檢測到的TRGs種類比LC處理多，因此本研究僅檢測了HC處理土壤中的TRGs.共檢測到9種TRGs（表1），其中4種為編碼核糖體保護蛋白的基因（tetB（P）、tetO、tetS、tetW），4種為編碼外排泵的基因（tetG、tetL、tetZ、tetC），1種（tetX）為編碼鈍化酶的基因.9種TRGs中只有tetO完全是由發酵豬糞帶入土壤，在不施肥土壤中沒有檢測到該基因.

在發酵豬糞中有12種TRGs被檢測到，其中5種為編碼核糖體保護蛋白的基因，7種為編碼外排泵的基因.在發酵豬糞中存在tetM、tetB、tetD 和tetY，并被帶到了土壤中，但是通過PCR方法并沒有在土壤中檢測到這4種TRGs，可能原因是經過土壤的稀釋作用、攜帶抗性基因細菌的死亡或者稻麥輪作環境的影響之后，這4種TRGs消解、不存在或者少量存在于土壤中.在土壤中檢測到的9種基因中，除了tetZ，其他的8種基因均曾在養豬場附近的土壤中檢測到［26］，而且Zhu等［31］也在施用堆肥的田間土壤中檢測到了tetO、tetW、tetC、tetG和tetL，說明這些基因廣泛存在于受人類農業活動影響的土壤中.

表1 發酵豬糞、施用9.0t/hm2發酵豬糞的土壤以及不施肥土壤中檢測到的TRGsTable 1 TRGs detected in the composted swine manure，the soil treated with 9.0t/hm2composted swine manure and soil without fertilizers

2.2 土壤中TRGs的絕對數量

經過連續6年的施肥處理，土壤中tetZ、tetC 和tetS的絕對數量與不施肥的土壤相比無顯著差異，表明這3種基因的絕對數量沒有受到施肥的顯著影響.而tetG、tetL、tetB（P）、tetW和tetO的絕對數量顯著提高（圖1），其中tetW、tetO和tetB（P）均屬于編碼核糖體保護蛋白的基因，tetL 和tetG屬于編碼外排泵的基因，說明發酵豬糞中攜帶的編碼核糖體保護蛋白和編碼外排泵的TRGs均能在施肥土壤中存留下來.在施肥土壤中tetG的數量最多，其次是tetL和tetB（P）. Zhu等［31］研究表明施用堆肥的土壤中tetG、tetL、tetA 和tetW的拷貝數最多，表明tetG和tetL在施用堆肥的土壤中大量存在.在不施肥的土壤中沒有檢測到tetO，而在施用發酵豬糞的土壤中tetO的數量超過了106copies/g.此外，0～5cm和5～10cm土層中的tetW、tetO、tetB（P）以及5～10cm土層的tetL受到了施肥用量的顯著影響，施肥量越高，這3種基因的絕對數量越高.而10～20cm土層中的tetW、tetO、tetB（P），0～5cm、10～20cm土層中的tetL，以及3個土層中的tetG絕對數量均不受施肥用量的影響；該結果表明在耕作層土壤中，上層土壤中的TRGs絕對數量受施肥用量的影響比下層土壤高，尤其是5～10cm土層最為明顯.

2.3 土壤中TRGs的相對豐度

為了降低土壤DNA提取效率和細菌數量背景值造成的影響，用TRGs的絕對數量與16S rRNA絕對數量的比值（即相對豐度）來分析攜帶TRGs的細菌在總細菌群落中所占的平均比例（圖2）.由表2可以看出:LC和HC處理的土壤中細菌16S rRNA的絕對數量顯著高于CK（大于10倍），說明發酵豬糞的施用顯著提高了土壤中細菌的數量；但是LC和HC處理土壤中tetZ、tetC 和tetS的絕對數量與CK無顯著差異（圖1）；因此在施肥土壤中，由于細菌群落數量擴大所造成的稀釋作用，使得攜帶tetZ、tetC和tetS的相對豐度顯著低于不施肥土壤.

在10～20cm土層中，tetW的數量變化與以上3種TRGs一樣，而在0～5cm和5～10cm土層中，HC處理中tetW的絕對數量顯著高于CK，而tetW的相對豐度與CK無顯著差異，說明連續施用發酵豬糞之后，0～5cm和5～10cm土層中的tetW絕對數量增加的幅度與細菌16S rRNA基因數量增加的幅度一致，這種增加可能是由于發酵豬糞提供的養分使土著抗性細菌繁殖引起，也有可能是發酵豬糞中攜帶的抗性細菌及抗性基因在土壤中的存活和繁殖引起，或者兩者的共同作用引起.

與CK相比，HC和LC處理中tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數量和相對豐度均顯著增加，說明施用發酵豬糞顯著提高了細菌種群中攜帶該類TRGs的平均數量.除tetO （0～5cm和5～10cm）的相對豐度受到了施肥量的影響外，其余7個基因以及10～20cm土層中的tetO的相對豐度均不受施肥重量的影響，可能是由于本研究設置的施肥量不足以引起土壤中的這7種TRGs產生顯著變化；或者是由于LC處理設置的施肥量已經使土壤中的這7種TRGs數量達到了最高閾值或平衡.Fahrenfeld等［32］提出土壤ARG的積累公式:ARG累積=ARG加入+ARG增加-ARG衰退±ARG徑流-ARG滲透（其中ARG增加是指由于宿主的繁殖增長、抗生素的選擇作用或ARG水平轉移引起的ARG增加），可能是由于該公式中的一個或多個因素影響了土壤中TRGs的數量，使得施用不同用量發酵豬糞的土壤中，除tetO外的7個TRGs均無顯著差異. tetO一般位于革蘭氏陽性細菌的質粒上，且多存在于好氧細菌中［33］，對豬糞進行好氧發酵處理可能有利于tetO的殘留.

圖1 施用發酵豬糞6年的土壤中8種TRGs的絕對數量Fig.1 The absolute abundance of the 8 TRGs in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure and the soil without fertilizers

表2 土壤和發酵豬糞中16S rRNA的絕對數量Table 2 The abundance of bacteria in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure， the soil without fertilizers and the composted swine manure

圖2 施用發酵豬糞6年后土壤中TRG的相對豐度Fig.2 The relative abundance of 8 TRGs in the soils treated with 4.5t/hm2and 9.0t/hm2composted swine manure as compared with the soil without fertilizers

在耕作層的3個土壤深度之間，同處理中的各TRGs相對豐度并無顯著差異，可能是因為本研究采集的是稻季末土壤，在水稻種植期淹水過程中，由于水分和養分的滲透擴散作用使攜帶同種TRGs的細菌在各處理耕作層土壤中均勻分布.

2.3 施用發酵豬糞對土壤TRGs的影響

發酵豬糞中的TRGs數量見表3，在分析的8 種TRGs中，tetG是土壤中數量最多的基因，而在發酵豬糞中數量最多的基因是tetL，其次是tetG 和tetZ，這3種基因的數量均超過了109copies/g（相對豐度＞1%）.表明本研究小型有機肥廠生產的供試發酵豬糞中殘留了多種TRGs，而這些殘留的TRGs影響了土壤中TRGs的組成和豐度.由于本研究只取了施肥6年中最近一次所施用的發酵豬糞進行分析，可能以前所施用的發酵豬糞中攜帶的TRGs種類或者數量與本次有所不同；但是，從圖1和圖2的結果可以看出，連續施用該發酵豬糞對土壤TRGs造成了顯著影響.因此，對于此類有機肥廠，仍需要改變發酵方法或優化發酵工藝來降低其中攜帶的抗性基因以削減可能造成的污染風險.

表3 發酵豬糞中TRGs的絕對數量和相對豐度Table 3 Relative abundance and absolute abundance of TRGs in the composted swine manure

糞肥主要通過以下3種方式影響土壤中的抗性基因:糞肥中殘留的抗生素對土著抗性細菌的選擇誘導作用，糞肥中抗性細菌的殘存和滲入，以及可在細菌群落中水平轉移的ARGs移動元件的匯集.已有研究表明向土壤中添加含有抗生素的水或者含有抗生素的稀釋有機質并不能誘導土壤抗性細菌的增加，而且幾乎不會改變微生物群落的組成［2］.因此推測發酵豬糞中殘留的抗生素不足以引起TRGs的顯著增加，發酵豬糞中的養分及其攜帶的抗性細菌和抗性基因可能是引起土壤TRGs數量增加的主要因素.

Ghosh等［34］發現以農學上可接受的頻率向農田施用經過處理的動物糞肥，不會引起土壤中抗性細菌的大量增加，而直接施用大量新鮮糞肥卻可以.雖然施用含有高水平抗性細菌的糞肥會短期內增加土壤微生物的抗性水平，但是在糞肥施用的6個月之內，土壤細菌的抗性水平會回到施肥前的水平［11］，說明糞肥驅動的抗性細菌可以在土壤中存活有限的一段時間，但是在這期間，土壤中的ARGs可能會水平轉移到土壤土著細菌中［34］.Schmitt等［13］檢測了豬糞和施用豬糞前后的土壤中的四環素類抗性基因，結果發現施用糞肥后的土壤中含有的一部分抗性基因是原來土壤所沒有的，是豬糞中特有的，證明這部分抗性基因是由于施用豬糞而帶入的.由于研究方法的不同，糞肥施用對土壤可培養抗性細菌數量的影響與其對土壤抗性基因的影響并不是一致的.

本研究表明，在稻麥輪作模式下，連續施用含有殘留TRGs的豬糞發酵有機肥會使土壤中某些TRGs的數量增加.由于抗性基因種類繁多，難以在研究中將所有已知種類的抗性基因全部包括，而且不同的抗性基因之間或許存在互補作用，某一類基因相對豐度的降低也可能伴隨著另外一種基因相對豐度的增加同時發生；此外，不同的抗性基因有著不同的結局，例如本研究中的tetZ 和tetO所呈現的研究結果完全不同，這可能不僅僅取決于抗生素的選擇作用，更取決于土壤中宿主細菌數量的消長以及基因發生水平轉移的趨勢.因此，創新研究ARGs的方法，深入了解不同ARG在環境中的特性及其污染風險，才能更好的指導農業及畜牧業生產活動，減少人類活動對環境ARGs的影響.

3 結論

3.1 本研究通過qPCR方法分析了連續施用攜帶TRGs的發酵豬糞對土壤TRGs數量的影響，在所分析的8種TRGs中，tetG、tetL、tetB（P）和tetO的絕對數量和相對豐度均明顯增加，而tetZ、tetC、tetS和tetW受到的影響相對較小.

3.2 tetO是分析的8種TRGs中受施肥用量影響較大的基因，其在0～5cm及5～10cm土層土壤中的數量與施肥的用量顯著正相關.

3.3 連續施用攜帶高量TRGs殘留的發酵豬糞會顯著增加土壤中TRGs的數量，發酵不徹底的豬糞與新鮮豬糞一樣具有污染環境的風險.

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Abundance of the tetracycline resistance genes in a paddy soil after continuous application of composted swine manure for 6 years.

PENG Shuang1，2，3， WANG Yi-ming1，2， LIN Xian-gui1，2*（1.State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008， China；2.Joint Open Laboratory of Soil and the Environment， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences and Hong Kong Baptist University， Nanjing 210008， China）. China Environmental Science， 2015，35（4）：1173～1180

In the present study， the occurrence and abundance of tetracycline resistance genes （TRGs） were investigated in a paddy soil after continuous application of composted swine manure （9.0t/hm2and 4.5t/hm2） for 6years. Nine classes of TRGs （tetW， tetB（P）， tetO， tetS， tetC， tetG， tetZ， tetL， and tetX） was detected in the soil applied with composted swine manure， among which the absolute abundance of tetG， tetL， tetB（P）， tetO， tetW were significantly increased， and there were significantly more copies of tetB（P）， tetW， tetO in the soil treated with 9.0t/hm2composted swine manure than with 4.5t/hm2， while the absolute abundance of tetZ， tetC and tetS was not influenced. There was no significant difference in the relative abundance of detected TRGs distributed with a depth of 0～5cm， 5～10cm， and 10～20cm in the same treatment. The relative abundance of tetG， tetL， tetB（P） and tetO was significantly increased in the soils treated with composted swine manure， but only tetO was influenced by the application weight of the manure. The results suggested that the residual TRGs in the composted swine manure shed further influence on the TRGs pool in soils with rice-wheat crop rotation， absolute and relative abundance of tetG， tetL， tetB（P） and tetO being significantly increased after continuous application of composted swine manure. Therefore， optimization of composting strategies is urgently needed to efficiently reduce the content of antibiotic resistance genes in the composted swine manure.

tetracycline resistance genes；manure；gene contamination；antibiotic resistance

X53，R944.6

A

1000-6923（2015）04-1173-08

彭 雙（1986-），女，河南信陽人，博士后，主要從事土壤微生物研究.發表論文5篇.

2014-08-12

國家自然科學基金（21377137，20607024）；中國科學院戰略性先導科技專項（XDA05020800）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD05B04）

* 責任作者， 研究員， xglin@issas.ac.cn