復發性膀胱尿路上皮癌中IMP3和CD44蛋白表達*

李沐寒邢添瑛賀慧穎

·臨床研究與應用·

復發性膀胱尿路上皮癌中IMP3和CD44蛋白表達*

李沐寒①邢添瑛②賀慧穎①

目的：評價IMP3和CD44蛋白在復發性膀胱癌中表達及二者的相關性。方法：收集2002年1月至2012年12月經尿道膀胱腫瘤電切術診斷為尿路上皮癌（UC）的病例，其中篩選出6個月內短期復發組25例和3年以上較長期首次復發組29例。應用半定量免疫組織化學法檢測短期復發組和較長期首次復發組UC病例中IMP3和CD44蛋白表達情況。結果：6個月內UC復發為25例，6例表達IMP3，且均為高級別UC。3年以上較長期首次UC復發為29例，僅有1例低級別UC表達IMP3。在短期復發組中IMP3陽性率為24%（6/25），表達強度為弱陽性16%（4/25）和強陽性8%（2/25），明顯高于較長期首次復發組中陽性率3.45%（1/29）以及表達強度中的弱陽性3.45%（1/29）和強陽性0（0/29）。CD44蛋白表達在兩組之間差異無統計學意義。IMP3表達與UC復發患者的腫瘤分期、分級呈正相關，而CD44表達與腫瘤的分級呈負相關。IMP3表達與CD44表達之間無明顯相關性。結論：IMP3在UC短期復發組中的表達明顯高于較長期首次復發組。IMP3可作為新的指標，并聯合腫瘤病理分期、分級等因素對膀胱UC患者經尿道腫瘤電切術后短期復發的高危性進行預測。

膀胱尿路上皮癌 復發 IMP3 CD44 免疫組織化學法

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC）。2015年美國預測新發膀胱癌患者74 000例，死亡16 000例。男性癌癥發病率中膀胱癌已上升至第4

位，死亡率為第8位［1］。在我國，2008年全國腫瘤登記地區膀胱癌發病率為7.49/10萬，居中國惡性腫瘤發病率第8位，并呈逐年增長趨勢，10年間的年均增長率為4.60%［2］。膀胱UC的顯著特點是初發多為非浸潤性且復發率高，越早發生復發的腫瘤越易進展，預后較差。目前預測膀胱UC復發的指征包括腫瘤的病理分期、分級、是否為多發腫瘤、腫瘤大小、手術方式、聯合化療藥物等［3-4］，但這些都有其局限性，不能準確的預測個體復發情況。因此對參與膀胱UC復發的相關分子的研究具有重要臨床意義，能夠為臨床綜合判斷預后及個體化治療提供依據。

胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白（insulinlike growth factorⅡmessenger RNA binding proteins，IMPs）是一類mRNA結合蛋白，能影響靶基因mRNA的定位、轉運和穩定性，包括IMP1、IMP2和IMP3。近年來的研究發現IMP3在眾多類型的腫瘤組織中高表達，而在成人良性組織中低表達或不表達，因此被稱為癌胚蛋白［5］，提示IMP3參與多種腫瘤的發生和發展。已有研究顯示IMP3可以作為膀胱UC一個獨立的不良預后指標［6］，但IMP3在復發性膀胱UC中的表達尚不清楚。CD44作為一種重要的細胞黏附分子，同時也是IMP3重要的靶分子之一，在膀胱癌中的報道不一，在我國復發性膀胱UC中的表達水平如何鮮有報道。因此本研究對IMP3和CD44在復發性膀胱UC的表達情況及二者之間有無相關性進行探討。

1 材料與方法

1.1研究材料

選取北京大學第三醫院病理科2002年1月至2012年12月期間經尿道膀胱腫瘤電切術中診斷為短期內復發（＜6個月）和較長期首次復發（＞3年以上）UC病例。由1位泌尿病理醫生重新閱片并進行組織學評級，為避免腫瘤分期不準確，標本中未見固有肌的病例均去除。6個月內短期復發組25例，3年以上較長期首次復發組29例列入本研究。54例復發性膀胱UC中男性42例，女性12例；年齡39～84歲，平均年齡65.7歲。組織切片標本根據世界衛生組織/國際泌尿病理學會（2004年）最新pT分期，其中Ta為30例，T1為14例，T2為10例。病理學分級中低級別28例，高級別26例。本研究獲得倫理委員會認可。

1.2試劑和方法

石蠟切片免疫組織化學法染色（Envision二步法）具體步驟如下：1）石蠟切片脫蠟水化；2）自來水沖洗2 min，蒸餾水沖洗2次；3）抗原修復（抗原修復液pH為6.0），水浴鍋煮沸20 min之后自然冷卻至室溫；4）3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫下30 min；5）PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；6）分別加入購于美國Corixa公司的IMP3鼠單克隆抗體和購于美國Abcam公司的CD44兔單克隆抗體，稀釋度均為1:100，4℃冰箱中過夜；7）PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；8）滴加北京中杉金橋公司PV9000兩步法試劑盒二抗，分別室溫孵育30 min；9）PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；10）美國DAKO公司DAB顯色3 min，Mayer's蘇木精復染細胞核，逐級酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3結果判斷

實驗中以PBS代替IMP3和CD44抗體作為陰性對照，分別由兩名高級病理醫師在光鏡下觀察染色切片，兩者判定結果符合率百分之百。IMP3陽性定位于細胞質，CD44陽性定位于細胞膜。本研究采用半定量的方法對切片免疫組織化學法的染色強度進行評分：無色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分。將染色程度和陽性細胞百分比的乘積進行評分：0分為陰性（-），＜6分為弱陽性，≥6分為強陽性。

1.4統計學分析

采用SAS 9.1統計軟件進行處理。計數資料行多獨立樣本的非參數分析（Kruskcal-Wallis檢驗）和Spearman相關性檢驗，計量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1IMP3和CD44蛋白在復發性膀胱UC中表達特點

IMP3主要在腫瘤組織的細胞質內表達，癌旁組織中無表達（圖1）。選取的54例復發性膀胱UC組織中IMP3總陽性表達率為12.96%（7/54），其中9.26%（5/54）弱表達、3.70%（2/54）強表達。6個月內短期復發組25例中高、低級別UC分別為20、5例，25例中IMP3表達占24%（6/25）、均為高級別UC。3年以上較長期首次復發組29例中高、低級別UC分別為6、23例，IMP3表達僅占3.45%（1/29）。IMP3陽性率及表達強度在短期復發組明顯高于較長期首次復發組（P=0.024 7，表1）。

CD44蛋白在正常膀胱黏膜基底細胞層強表達，但在表層的尿路上皮細胞無表達，其在膀胱UC中主要在腫瘤組織的細胞膜上表達，同時間質、淋巴細胞和平滑肌也可呈強陽性。54例復發性膀胱UC中CD44陽性率為48.15%（26/54），其中29.63%（16/54）弱表達、18.52%（10/54）強表達（圖2）。CD44表達在短期復發組和較長期首次復發組間差異無統計學意義（P=0.237 4，表1）。

圖1 復發性膀胱UC中IMP3表達（Envision法×200）Figure 1Expression of IMP3 in recurrent UC of bladder（Envision×200）

表1 短期復發組和較長期首次復發組中IMP3和CD44蛋白表達Table 1Expression of IMP3 and CD44 proteins in the short-term and long-term recurrent groups

圖2 復發性膀胱UC中CD44表達（Envision法×200）Figure 2Expression of CD44 in recurrent UC of bladder（Envision×200）

2.2IMP3蛋白表達與膀胱UC患者臨床病理特征關系

IMP3陰性、弱陽性和強陽性患者的年齡分別為（65.64±10.03）歲、（61.2±8.53）歲和（69±5.66）歲。IMP3蛋白表達與膀胱UC pT分期（P=0.017 1）和分級（P=0.027 9）呈正相關，即分期、分級越高，IMP3陽性強度越高，而與患者的年齡、性別無相關性（P＞0.05，表2）。

表2 IMP3蛋白表達與復發性膀胱UC患者臨床病理特征關系Table 2Relationship between the IMP3 protein expression and various clinicopathologic features in the recurrent UC patients

2.3CD44蛋白表達與膀胱UC患者臨床病理特征關系

CD44陰性、弱陽性和強陽性患者的年齡分別為（66.64±10.03）歲、（65.47±10.73）歲和（64.81±11.78）歲。CD44蛋白表達與年齡、性別和T分期無相關性（P＞0.05），但與病理分級呈負相關，即病理分級越高CD44陽性強度越低（P=0.000 3，表3）。

2.4IMP3與CD44蛋白在復發膀胱UC中表達的相關性

復發性膀胱UC中，7例IMP3陽性表達的患者中5例CD44不表達，IMP3與CD44之間并不存在相關性（P=0.199 0，表4）。

表2 IMP3蛋白表達與復發性膀胱UC患者臨床病理特征間的關系（續表2）Table 2Relationship between the IMP3 protein expression and various clinicopathologic features in the recurrent UC patients

表3 CD44蛋白表達與復發性膀胱UC患者臨床病理特征關系Table 3Relationship between CD44 protein expression and various clinicopathologic features in the recurrent UC patients

表4 復發性膀胱UC中IMP3與CD44的相關性Table 4Correlation between the expression of IMP3 and CD44 proteins in recurrent UC patients

3 討論

IMP3在多種惡性腫瘤中過表達，且與部分腫瘤的早期復發有關，如胃癌［7］、上尿道UC［8］等。IMP3在膀胱UC中的表達情況雖有一些報道，但表達率差別較大。Sitnikova等［6］研究表明在淺表性膀胱UC中IMP3表達的陽性率為19.6%，而在轉移性膀胱UC中的陽性率高達93%。我國何學軍等［9］報道，在膀胱UC活檢、部分和全切標本中IMP3陽性率為62.5%（33/48），且IMP3在淺表組（46.15%）、低級別組（46.43%）中的表達明顯低于其在固有肌層浸潤組（81.82%）、高級別組（85.00%）中的表達。本研究發現，在復發性膀胱UC活檢標本中IMP3表達率較低，僅12.96%（7/54）且基本上都表達于短期復發的高級別膀胱UC患者中。本研究短期復發組的25例患者中16例未發生固有肌層浸潤，其中Ta期10例、T1期6例，5例為低級別，說明只根據分期、分級很難準確預測患者的短期復發情況。本研究表明，在復發性膀胱UC患者中IMP3表達與腫瘤病理分期、分級呈正相關，且表達率和表達強度在短期復發組中要高于較長期首次復發組患者。

IMP3是一種mRNA結合蛋白，Vikesaa等［10］報道在HeLa細胞中IMP3可以結合到CD44 mRNA上使其表達穩定，從而增強HeLa細胞的黏附能力，促進侵襲偽足的形成。在肝癌中的研究發現IMP3可以聯合標

準型CD44（CD44s）作為判斷患者預后的新指標，兩者共同高表達預示患者的不良預后［11］。Szarvas等［12］報道在侵襲性膀胱UC中IMP3蛋白的表達預示著預后不良且與CD44蛋白并無直接關系。CD44蛋白在膀胱UC中的研究結果差別較大，主要集中在CD44s和變異性CD44（CD44v6）上。Lipponen等［13］研究表明CD44s在膀胱UC腫瘤細胞非基底層的表達增強與不良預后有關，而在基底層和非基底層CD44v6高表達的患者生存率較高，但Sugino等［14］認為在早期膀胱UC中CD44基因高表達，而其丟失與腫瘤細胞獲得侵襲性相關，Matuschek等［15］則認為CD44s mRNA高表達和CD44v6 mRNA低表達與良好預后相關。本研究表明，在我國復發性膀胱UC中，CD44表達與腫瘤病理分級呈負相關，但在短期復發和較長期首次復發兩組患者中的表達并無差別，并且與IMP3表達無相關性。在膀胱UC中IMP3作用的分子機制很可能不是通過結合CD44 mRNA來發揮的。

綜上所述，IMP3可以作為新的指標聯合腫瘤病理分期、分級等因素共同預測膀胱UC患者經尿道腫瘤電切術后短期復發的高危性，但IMP3作用的具體分子機制還有待進一步探究。

［1］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Can?cer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［2］Han SJ，Zhang SW，Chen WQ，et al.Analysis of the status and trends of bladder cancer incidence in China［J］.Oncology Prog?ress，2013，11（1）：89-95.［韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國膀胱癌發病現狀及流行趨勢分析［J］.癌癥進展，2013，11（1）：89-95.］

［3］Witjes JA，Compérat E，Cowan NC，et al.EAU guidelines on muscle-invasive and metastatic bladder cancer：summary of the 2013 guidelines［J］.Eur Urol，2014，65（4）：778-792.

［4］Babjuk M，Burger M，Zigeuner R，et al.EAU Guidelines on non -muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder：update 2013［J］.Eur Urol，2013，64（4）：639-653.

［5］Yaniv K，Yisraeli JK.The involvement of a conserved family of RNA binding proteins in embryonic development and carcino?genesis［J］.Gene，2002，287（1-2）：49-54.

［6］Sitnikova L，Mendese G，Liu Q，et al.IMP3 predicts aggressive superficial urothelial carcinoma of the bladder［J］.Clin Cancer Res，2008，14（6）：1701-1706.

［7］Okada K，Fujiwara Y，Nakamura Y，et al.Oncofetal protein，IMP-3，a potential marker for prediction of postoperative perito?neal dissemination in gastric adenocarcinoma［J］.J Surg Oncol，2012，105（8）：780-785.

［8］Lee DJ，Xylinas E，Rieken M，et al.Insulin-like growth factor messenger RNA-binding protein 3 expression helps prognostica?tion in patients with upper tract urothelial carcinoma［J］.Eur Urol，2014，66（2）：379-385.

［9］He XJ，Liu WG，She SY，et al.Expression of insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3 in transitional cell carcinoma of the bladder and its clinical significance［J］.Clin Med China，2011，27（1）：82-85.［何學軍，劉文剛，佘紹逸，等.胰島素樣生長因子II mRNA結合蛋白3在膀胱移行細胞癌的表達及意義［J］.中國綜合臨床雜志，2011，27（1）：82-85.］

［10］Vikesaa J，Hansen TV，J?nson L，et al.RNA-binding IMPs pro?mote cell adhesion and invadopodia formation［J］.EMBO J，2006，25（7）：1456-1468.

［11］Hu S，Wu X，Zhou B，et al.IMP3 combined with CD44s，a nov?el predictor for prognosis of patients with hepatocellular carcino?ma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2014，140（6）：883-893.

［12］Szarvas T，vom Dorp F，Niedworok C，et al.High insulin-like growth factor mRNA-binding protein 3（IMP3）protein expres?sion is associated with poor survival in muscle-invasive bladder cancer［J］.BJU Int，2012，110（6 Pt B）：E308-317.

［13］Lipponen P，Aaltoma S，Kosma VM，et al.Expression of CD44 standard and variant-v6 proteins in transitional cell bladder tu?mours and their relation to prognosis during a long-term fol?low-up［J］.J Pathol，1998，186（2）：157-164.

［14］Sugino T，Gorham H，Yoshida K，et al.Progressive loss of CD44 gene expression in invasive bladder cancer［J］.Am J Pathol，1996，149（3）：873-882.

［15］Matuschek C，Lehnhardt M，Gerber PA，et al.Increased CD44s and decreased CD44v6 RNA expression are associated with bet?ter survival in myxofibrosarcoma patients：a pilot study［J］.Eur J Med Res，2014，19：6.

（2014-12-26收稿）

（2015-03-30修回）

IMP3 and CD44 protein expression in recurrent bladder urothelial carcinoma

Muhan LI1，Tianying XING2，Huiying HE1

Huiying HE；E-mail：huiyinghe@bjmu.edu.cn

Objective：To evaluate the expression of IMP3 and CD44 proteins in recurrent urothelial carcinoma（UC）and to determine the correlation between the two proteins.Methods：Data from transurethral resection of bladder（TURB）cancer cases between January 2002 and December 2012 were reviewed.Of the 54 UC recurrent cases in this study，one group of 25 had experienced recurrence within 6 months after surgery，and the other group of 29 had their first recurrence after more than 3 years.IMP3 and CD44 immunoreactivities were increased，which correlated with the clinicopathologic parameters.The relationship between IMP3 and CD44 protein expressions was also explored.Results：Six of the 25 short-term recurrent UC cases were tested positive for IMP3 and all belonged to high-grade UC.Among the 29 long-term recurrent patients，only one case of low-grade UC tested positive for IMP3.IMP3 expression rate［24%（6/25）］and intensity［weak staining at 16%（4/25）and strong staining at 8%（2/25）］were higher in the short-term recurrent group than those in the long-term group，which had an expression rate of 3.45%（1/29）and intensity rates for weak staining at 3.45%（1/29）and without strong staining（0/29）.No difference was observed in the CD44 expression between the two groups.In addition，the high expression of IMP3 correlated with higher tumor stage and grade，whereas the CD44 expression tended to be inversely correlated with the tumor grade in recurrent UC patients.Furthermore，no correlation existed between the expression of IMP3 and CD44 proteins in the bladder carcinoma specimens.Conclusion：IMP3 exhibited a significantly higher expression rate in short-term recurrent UC specimens than in the long-term recurrent cases.Therefore，IMP3 could be used as a novel marker，together with the other factors including tumor stage and grade，for predicting the high risk of short-term recurrence in UC patients who underwent TURB.

urothelial carcinoma of bladder，recurrence，IMP3，CD44，immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.20142132

①北京大學醫學部基礎醫學院病理學系（北京市100191）；②北京大學第三醫院泌尿外科

*本文課題受國家自然科學青年科學基金項目（編號：81001135）資助

賀慧穎huiyinghe@bjmu.edu.cn

1Department of Pathology，Peking University School of Basic Medical Science，and2Department of Urology，The Third Hospital of Peking University，Beijing 100191，China

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Investigators（No.81001135）

李沐寒專業方向為泌尿男性生殖系統腫瘤進展分子機制。

E-mail：limuhan8816@163.com