上皮間充質轉化對肺鱗狀細胞癌侵襲和遷移能力的影響*

鄭燕君孫保存③趙秀蘭③鄭旭李巖磊邱志強古強③董學易③張艷輝

·基礎研究·

上皮間充質轉化對肺鱗狀細胞癌侵襲和遷移能力的影響*

鄭燕君①孫保存①②③趙秀蘭①③鄭旭①李巖磊①邱志強②古強①③董學易①③張艷輝②

目的：研究肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCC）上皮間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的臨床意義，并闡述EMT對肺鱗癌侵襲轉移能力的影響。方法：對79例肺鱗癌組織切片進行E-cadherin、Vimentin及TGF-β1的免疫組織化學染色，分析其臨床意義。將肺鱗癌細胞系SK-MES-1置于含有不同濃度轉化生長因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）的培養(yǎng)基中，分別誘導培養(yǎng)5、10 d后，利用Western blot、RT-PCR檢測E-cadherin、Vimentin的表達變化，以劃痕、侵襲實驗來判斷不同濃度、誘導時間對SK-MES-1細胞功能的影響。結果：肺鱗癌發(fā)生淋巴轉移病例中E-cadherin表達較未發(fā)生淋巴轉移者低，而Vimentin表達則高于未發(fā)生淋巴轉移的病例，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TGF-β1陽性表達與淋巴結轉移相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot和RT-PCR顯示10 ng/mL TGF-β1誘導培養(yǎng)的SK-MES-1細胞中，Vimentin表達增強明顯，E-cadherin表達減弱。細胞劃痕和侵襲實驗結果表明SK-MES-1經誘導后，遷移和體外侵襲能力增強。結論：肺鱗癌的淋巴轉移與上皮間充質轉化有關，TGF-β1可誘導肺鱗癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲和遷移的能力。

上皮間充質轉化 肺鱗狀細胞癌 TGF-β1 侵襲 遷移

肺癌是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，臨床上約80%以上的肺癌患者死于腫瘤的侵襲與轉移。因此，研究肺癌侵襲轉移中相關基因的表達對判斷預后及指導臨床治療具有重要意義。研究發(fā)現上皮細胞間充質轉化（EMT）參與多種腫瘤的浸潤轉移，是腫瘤侵襲轉移的一個重要的分子機制［1］。本研究對肺鱗癌組織的病理切片進行免疫組織化學方法檢測E-cadherin、Vimentin、TGF-β1的表達并分析其臨床意義，并利用TGF-β1因子誘導肺鱗癌細胞系，觀察其E-cadherin、Vimentin的變化，探討上皮間充質轉化在肺鱗狀細胞癌發(fā)生侵襲、轉移的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院1996年1月至2003年2月手術切除且臨床資料完整的肺鱗狀細胞癌標本79例，其中男性61例，女性18例；年齡35～74歲，平均年齡（60.46±9.08）歲。隨訪時間截至2011年12月，術后生存時間為9 d～158個月，中位生存時間為26個月。根據WHO國際癌癥TNM分期標準（第6版）：Ⅰ期29例，Ⅱ期33例，Ⅲ期17例，Ⅳ期0例。以上結果均經兩位有豐富經驗的病理醫(yī)師閱片驗證。本研究獲患者知情同意并獲天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑兔抗人多克隆抗體E-cadherin（1：100稀釋）購于北京中杉公司；兔抗人多克隆抗體Vimentin（1：400稀釋）購自美國Epitmics公司；兔抗人多克隆抗體TGF-β1（1：50稀釋）購于北京中杉公司；肺鱗癌細胞株SK-MES-1購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心；MEM培養(yǎng)基購自天津BIOROC公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）購自美國Peprotech公司；β-actin購自美國SantaCruz公司；Matrigel基質購自美國BD公司；Transwell侵襲小室購于美國Corning公司，PCR引物購自中國廣州復能基因公司，RNA提取試劑Trizol、Reverse Transcription System反轉錄試劑、PCR反應Taq酶試劑盒，均購于北京Tiangen公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色步驟免疫組織化學染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，5 μm連續(xù)切片常規(guī)脫蠟水化；3%H2O2滅活；微波熱修復；正常血清室溫下封閉，一抗4℃冰箱過夜；次日滴加二抗，室溫反應1 h；DAB顯色，蘇木素淺染細胞核；脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.2免疫組織化學染色結果判定采用Mattern積分法評定染色結果。每例標本隨機選擇10個有代表性的高倍鏡視野，分別記數100個腫瘤細胞，取其平均值作為陽性細胞百分率。規(guī)定陽性細胞百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度中基本不著色、淺黃、深黃和棕色分別為0、1、2、3分。染色指數為陽性細胞百分率與染色強度之和，最小值為0，最大值為6。表達指數＞3為陽性；≤3則為陰性。

1.2.3細胞培養(yǎng)SK-MES-1肺鱗癌細胞系在含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中，放入37℃、5%CO2孵化箱中孵育，待細胞融合約90%時，傳代以保持細胞的活力。

1.2.4TGF-β1誘導培養(yǎng)及細胞分組取生長旺盛的SK-MES-1細胞株，0.25%胰酶消化、離心后加入培養(yǎng)液（90%MEM+10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），并將該細胞系分為5組進行實驗：1）MEM完全培養(yǎng)基中加5 ng/mL TGF-β1，培養(yǎng)5 d；2）MEM完全培養(yǎng)基中加10 ng/mL TGF-β1，培養(yǎng)5 d；3）MEM完全培養(yǎng)基中加5 ng/mL TGF-β1，培養(yǎng)10 d；4）MEM完全培養(yǎng)基中加10 ng/mL TGF-β1，培養(yǎng)10 d；5）對照組：MEM完全培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每天觀察其形態(tài)變化。

1.2.5Western blot檢測使用細胞裂解液裂解，分別以5 ng/mL和10 ng/mL TGF-β1誘導5 d和10 d的肺鱗癌細胞，提取其總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入E-cadherin（1：100）、Vimentin（1：500）、β-actin（1：2 000）一抗，4℃過夜。第2天取出膜，TBST漂洗后，加入山羊抗兔IgG抗體反應，室溫孵育2 h，TBST漂洗。化學發(fā)光法顯影，于暗室曝光。

1.2.6RT-PCR檢測按照Trizol提取試劑盒，對每組細胞分別提取總RNA，經分光光度計定量后，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA后進行PCR反應。將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描結果，用Photoshop軟件進行條帶灰度分析，分別計算與內參的灰度值比。人E-cadherin的引物序列為F：5'-G TCACTGACACCAACGATAATCCT-3'，R：5'-GTCAC TGACACCAACGATAATCCT-3'；Vimentin的引物序列為F：5'-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3'，R：5'-G GTCATCGTGATGCTGAGAA-3'；內參GAPDH的引物序列為F：5'-CCTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3'，R：5'-TGTCATACCAGGAAATGAGCTTG-3'。

1.2.7細胞劃痕實驗以合適的密度將細胞接種于6孔板，于37℃孵箱中培養(yǎng)；待培養(yǎng)細胞生長至80%融合度時，用100 μL移液槍頭在細胞表面造成劃痕，并在倒置顯微鏡下觀察，拍照記錄劃痕間初始距離（0 h）；在24、48 h后，40倍鏡下拍照記錄劃痕間的距

離，計算細胞的相對遷移率。實驗重復3次。

1.2.8侵襲實驗冰上操作，在Transwell小室濾膜內表面涂以無血清MEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel膠35 μL（0.25 μg/μL），37℃孵育1 h使Matrigel膠在微孔濾膜上重組成為基底膜結構后備用；在24孔板內加入含0.1%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液500 μL/孔；用含0.1%胎牛血清的MEM無血清培養(yǎng)液調整各組細胞濃度為2×106/mL，在小室內加入200 μL細胞懸液后，將小室浸入24孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱內孵育48 h；將Transwell小室取出，用4%的冷甲醇固定3～5 min；結晶紫染色5 min，水洗；用棉簽拭去微孔濾膜上的Matrigel膠和未穿過膜的細胞；于200倍相差顯微鏡下，應用ACT-2U軟件（Nikon Corporation）捕捉圖像并計數濾膜上下左右中5個不同視野下穿過膜的細胞數，計算均值。每種細胞平行設2張濾膜，實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行分析。計量資料以x±s表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肺鱗狀細胞癌中E-cadherin、Vimentin以及TGF-β1的表達與淋巴結轉移的關系

在79例的肺鱗癌病例中，E-cadherin的陽性表達為59例（74.7%），Vimentin的陽性表達為16例（20.3%）（圖1A，1B）。E-cadherin及Vimentin的表達均與年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05），但與淋巴結轉移有關（表1）。79例肺鱗癌病例中發(fā)現17例TGF-β1表達呈陽性（圖1C），并與淋巴結轉移相關，差異具有統(tǒng)計學意義（表1）。在后續(xù)實驗中，利用TGF-β1因子在體外進行肺鱗癌細胞系誘導實驗。

圖1 免疫組織化學染色檢測肺鱗癌中E-cadherin、Vimentin和TGF-β1的表達（×200）Figure 1Immunohistochemical staining of E-cadherin，Vimentin and TGF-β1 in lung squamous cell carcinoma（×200）

表1 E-cadherin、Vimentin、TGF-β1在79例肺鱗癌的表達與腫瘤臨床特征的關系例Table 1Relationship between the expression levels of E-cadherin，Vimentin，and TGF-β1 in 79 LSCC patients and clinical features of the tumor

2.2TGF-β1誘導肺鱗癌細胞后E-cadherin、Vimentin的表達情況

Western blot結果顯示，在TGF-β1條件培養(yǎng)基（濃度10 ng/mL）誘導10 d后的SK-MES-1細胞中Vimentin表達明顯增強，而E-cadherin表達減弱（圖2），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣利用RT-PCR檢測誘導后的SK-MES-1細胞，結果顯示經不同濃度、天數誘導后，E-cadherin的表達受到了抑制，Vimentin得到了增強（圖3），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 Western blot檢測SK-MES-1經TGF-β1誘導后E-cadherin、Vimentin的表達水平Figure2E-cadherin and Vimentin expression levels in SK-MES-1 cells after TGF-β1 induction detected via Western blot

圖3 RT-PCR檢測SK-MES-1經TGF-β1誘導后E-cadherin、Vimentin的表達水平Figure 3E-cadherin and Vimentin expression levels in SK-MES-1 cells after TGF-β1 induction detected via reverse transcription-polymerase chain reaction

2.3細胞劃痕實驗

采用經典的細胞劃痕實驗來評價TGF-β1誘導后肺鱗癌細胞系SK-MES-1的遷移能力。結果表明肺鱗癌細胞系經細胞因子誘導后，其遷移能力明顯增強，其中5 ng/mL和10 ng/mL TGF-β1誘導10 d組的肺鱗癌細胞在48 h劃痕完全愈合。兩組劃痕愈合速度均明顯高于對照組（圖4），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4Transwell體外侵襲實驗

腫瘤細胞侵襲基底膜是腫瘤轉移過程中的重要環(huán)節(jié)，Matrigel膠鋪在孔徑為8.0 μm的多聚碳酸脂膜上，能在培養(yǎng)基中重組形成與天然基底膜極為相似的膜結構。具有侵襲能力的細胞在趨化劑的誘導下可穿過濾膜。將穿過濾膜的細胞數進行統(tǒng)計可檢測腫瘤細胞的侵襲能力。將小室浸入24孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵育48 h后，與對照組相比，經過誘導的肺鱗癌細胞侵襲至濾膜下表面的細胞數增加，其中5 ng/mL和10 ng/mL TGF-β1誘導10 d肺鱗癌SK-MES-1細胞的體外侵襲能力明顯增強（圖5），約是5ng/mL誘導5d組的3倍，是對照組的5倍（P＜0.01）。

圖4 SK-MES-1細胞經TGF-β1誘導5 d、10 d后，劃痕實驗測定細胞遷移能力及細胞遷移速度。實驗組與對照組相比較，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）Figure 4After 5 and 10 days of culture by TGF-β1 induction，the migration and invasive abilities of SK-MES-1 cells were detected by wound scratch test.Significant differences were found between the experimental and control groups（P＜0.05）

圖5 SK-MES-1細胞經TGF-β1誘導5 d、10 d后的Transwell體外侵襲實驗Figure 5Invasion assay，with SK-MES-1 cells at 5 or 10 days after TGF-β1 induction

3 討論

上皮間充質轉化（epithelia-mesenchymal transition，EMT）為Creighton等［2］于1982年提出，是指在某些生理、病理及環(huán)境等因素作用下，上皮細胞失去細胞極性及細胞間連接而轉變?yōu)榫哂虚g質細胞形態(tài)和特性細胞的過程，從而獲得浸潤性和游走遷移能力的過程。因此，EMT與人體病理情況包括纖維化、腫瘤轉移密切相關。上皮細胞表型的喪失和間質特性的獲得是EMT發(fā)生的主要特征。第一，細胞粘附分子表達減少導致了上皮細胞失去原本細胞間的粘附作用；第二，原先的細胞骨架以角蛋白為主轉變?yōu)閂imentin為主，從而形成了紡錘狀細胞，但有時EMT也會發(fā)生功能改變，形態(tài)卻不改變的情況。這種表型的轉化就使腫瘤細胞擺脫細胞間粘附，表現得更具侵襲能力［3］。EMT也會促使一些參與細胞外基質、基底膜降解和破壞的溶解酶，從而破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，便于細胞從原發(fā)腫瘤分離脫落，從而發(fā)生侵襲轉移。通常認為EMT發(fā)生在腫瘤轉移的起始階段［4］。E-cadherin主要表達于上皮細胞，是參與細胞間粘附，維持細胞完整性的一類介導細胞間粘附的鈣依賴性跨膜蛋白，是EMT的關鍵分子。有研究發(fā)現在肝癌、結腸癌中，E-cadherin低表達與腫瘤的轉移有關［5-6］。也有相關研究［7］通過對肺腺癌免疫組化染色，進行上皮標志蛋白的表達檢測，發(fā)現E-cadherin表達與肺腺癌的分化程度呈正相關，并發(fā)現E-cadherin低表達的患者預后較差。Vimentin是一種重要的細胞骨架蛋白，廣泛表達于各種內皮細胞等間質細胞內。研究發(fā)現，乳腺癌、肝癌中Vimentin表達增高［8-9］，但Vimentin在非小細胞肺癌中表達異常［10-11］。本研究顯示，在79例肺鱗癌患者中，有25.3%的病例E-cadherin表達缺失，在這些E-cadherin陰性表達的病例中，淋巴結轉移的陽性率高于未發(fā)生淋巴結轉移的；而Vimentin陽性表達病例中，淋巴結轉移陽性率同樣高于未發(fā)生的淋巴結轉移組。

TGF-β是誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT的關鍵因子，其通過Smad和非Smad信號通路誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT。TGF-β具有調節(jié)細胞生長、凋亡、分化和遷移多種功能。在癌癥的發(fā)展過程中，TGF-β發(fā)揮了初期的腫瘤抑制和中后期腫瘤促進的雙向作用。TGF-β作為一種腫瘤促進因子，刺激組織纖維化和細胞外基質沉積，擾亂免疫功能，刺激血管生成和促進上皮間充質轉化。本研究中，肺鱗癌病例中有17例TGF-β1過表達，與淋巴結轉移具有相關性。從而選擇TGF-β1因子在體外細胞實驗中進行誘導，觀察誘導后的肺鱗癌細胞系是否發(fā)生EMT。實驗結果表明，誘導后的肺鱗癌細胞系Vimentin表達明顯增強，E-cadherin表達減弱，證實了EMT的發(fā)生。通過侵襲實驗等相關功能實驗也進一步證實了發(fā)生EMT的肺鱗癌細胞系侵襲和轉移能力均有提高。

EMT不僅在胚胎形成發(fā)育中起重要作用，而且

在腫瘤侵襲轉移中同樣也發(fā)揮重要作用。因此，EMT分子調控機制研究為預防腫瘤轉移提供一個有利的平臺。EMT調控因子可使腫瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤侵襲轉移。有研究證實，通過上調肺腺癌細胞中Oct4和Nanog表達，可促發(fā)EMT進程，并增加癌細胞轉移、侵襲［12-13］。體外經TGF-β1誘導的肺腺癌細胞系失去了上皮特性，獲得了間質細胞表型，也有著較強的侵襲、遷移能力［14-15］，與本研究的結果一致。一些研究也表明，E-cadherin的缺失與肺癌的進展、遠處轉移以及較差的預后有關。目前有研究已經通過各種方法抑制EMT而降低腫瘤的侵襲與轉移，有針對TGF-β1抑制EMT的相關實驗，從而逆轉腫瘤侵襲，如使用TGF-β阻滯劑降低腫瘤的侵襲性［16-17］。

綜上所述，本研究提示在肺鱗狀細胞癌的轉移、侵襲發(fā)生中，EMT調控起了關鍵作用。因此誘導EMT發(fā)生的調控基因，便成為進一步研究的主要內容。但目前EMT的發(fā)生所涉及的調控機制，大多數還是建立在體外實驗基礎上，由于體內外環(huán)境差別較大，要想更好地了解EMT在腫瘤侵襲轉移中的作用，還有待進一步開展EMT在體內的相關研究。

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（2014-12-09收稿）

（2015-01-08修回）

（編輯：楊紅欣）

Effect of epithelial-to-mesenchymal transition on the invasion and migration abilities of lung squamous cell carcinoma

Yanjun ZHENG1,Baocun SUN1,2,3,Xiulan ZHAO1,3,Xu ZHENG1,Yanlei LI1,Zhiqiang QIU2,Qiang GU1,3,Xueyi DONG1,3,Yanhui ZHANG2

Baocun SUN;E-mail:sunbaocun@aliyun.com

Objective:To investigate the clinical significance of epithelial-to-mesenchymal(EMT)in lung squamous cell carcinoma(LSCC)and to examine the effect of EMT on the invasive and migration abilities of LSCC.Methods:Immunohistochemical staining was performed to determine the expression of E-cadherin,Vimentin,and TGF-β1 in 79 LSCC patients,and the clinical significance was explored.SK-MES-1 lung squamous carcinoma cells were cultured in conditioned medium containing various concentrations of transforming growth factor-β1(TGF-β1)for 5 and 10 days.The expression levels of E-cadherin and Vimentin were detected via Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).With different concentrations and induction times,invasion and wound healing assays were performed to evaluate the invasion and migration abilities.Results:E-cadherin expression was significantly lower,whereas Vimentin expression was significantly higher in LSCC with lymph node metastasis than in that without noda metastasis (P<0.05).In the tissues of 79 LSCC patients,TGF-β1 expression was significantly related to lymph node metastasis(P<0.05).Western blot showed that Vimentin expression was higher,whereas E-cadherin expression was lower in TGF-β1 inducing medium with 10 ng/ mL SK-MES-1 cells than in the other media.RT-PCR showed similar results.Scratch test and invasion assay both showed that treatment of cells with cytokines markedly enhanced the migration and invasion of the cells.Conclusion:Lymph node metastasis of LSCC correlates with EMT.SK-MES-1 cells undergo EMT via TGF-β1 induction,which enhances invasion and migration.

epithelial-to-mesenchymal transition,lung squamous cell carcinoma,TGF-β1,invasion;migration

10.3969/j.issn.1000-8179.20142037

①天津醫(yī)科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科；③天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）和國家自然科學基金面上項目（編號：81173091）資助

孫保存sunbaocun@aliyun.com

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China;3Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

This work was supported by the Key Project of the National Natural Science Foundation of China(No.81230050)and the National Natural Science Foundation of China(No.81173091)

鄭燕君專業(yè)方向為腫瘤病理學。

E-mail：zhengyanjun.student@sina.com