穴位埋線對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究

鄭鳳鳴 郝小波 趙建英 張 蓮 郭大東

穴位埋線對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎治療作用的研究

鄭鳳鳴1郝小波2趙建英2張 蓮3郭大東4

目的探討穴位埋線對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用。方法Liwes大鼠48只，采用隨機數字表法分為對照組、模型組、穴位埋線組，每組16只。將光感受器間維生素A類結合蛋白（IRBP）、結核桿菌（TB）和完全弗氏佐劑（CFA）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）制成乳糜液后，在雙足后墊及背部兩側皮下注射。穴位埋線組于造模后第二天進行穴位埋線；模型組、穴位埋線組于造模后第9、13、18、23 d采集心臟血液并分離淋巴結中T淋巴細胞，進行流式細胞儀分析，同時對眼球進行組織病理切片。結果造模后第6至7 d大鼠眼部開始出現炎癥反應，第13 d炎癥達高峰（模型組臨床評分為：3.42±0.58；穴位埋線組為：2.17±0.68，P=0.018，差異有統計學意義），之后逐漸開始消退。組織病理學結果顯示模型組在第9、13、18、23 d時虹膜，睫狀體及視網膜炎癥均比穴位埋線組嚴重，而空白對照組眼部結構完整，未見明顯炎癥表現；流式細胞儀分析顯示第13 d CD4+T占細胞比例最高值：模型組為85.97±1.03，穴位埋線組為：79.51±0.64，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.001）；第13 d時CD8+T最低：模型組為：14.03±1.03，組為：20.49±0.64，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。結論眼形態學、組織病理、細胞水平等結果顯示，穴位埋線可有效減輕實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠炎癥水平，對大鼠的葡萄膜炎具有治療作用。

穴位埋線；自身免疫；葡萄膜炎；流式細胞術；組織病理學

葡萄膜炎是一類嚴重威脅人類視覺健康的自身免疫性眼病，多發生于青壯年，具有病因復雜多樣、病情長且易反復發作等特點，我國約有500萬患者，是我國亟待解決的公共衛生問題。目前治療主要以糖皮質激素及相應的抗炎藥為主，使用周期長，副作用非常明顯，可引發患者免疫功能紊亂等全身性并發癥，且患者在停藥或者減少服藥劑量后經常出現病情復發或者加重。近年來有學者研究發現，將糖皮質激素直接注射入玻璃體腔內，雖不易引發全身并發癥，但易引發白內障、眼內炎、眼壓升高等眼局部并發癥〔1〕。臨床研究發現，穴位埋線對慢性葡萄膜炎具有一定的治療作用〔2〕，患者依從性好。本實驗主要研究穴位埋線對實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠（experimental autoimmune uveitis，EAU）的作用機制，為穴位埋線治療葡萄膜炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康Lewis大鼠48只（購于常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證為SCXK（蘇）2011-0003），CL級別，體重130～170 g，均為雌性。所有動物均按照視覺與眼科學研究學會中對動物進行眼科與視覺研究實驗的要求飼養與處理。

埋線材料及主要實驗試劑、儀器：埋線材料由北京任曉艷穴位埋線醫療研究中心提供［專利號：2004200665990，京藥監械（準）字2005第2270643號，京藥管械生產許20040062號］；光感受器間維生素A類結合蛋白（IRBP，1177-1191，氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV）由上海生工生物工程股份有限公司合成；結核菌素（tuberculin，TB）購自美國Difco公司；完全弗氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA）購自美國Sigma公司；Phycoerythrin（PE）anti-rat CD8a和FITC Mouse Anti-Rat CD4購自美國eBioscience公司；1640為Gibco公司產品。Genesis-D動物眼部照相機（日本Kowa公司）；流式細胞儀為美國BD FACSVerse產品；顯微鏡（Olympus IX71）由日本公司生產，超速冷凍臺式離心機由香港力康公司生產。

1.2 動物分組與（葡萄膜炎誘導）造模

分組：將48只大鼠按隨機數字表分為對照組（注射生理鹽水）、模型組（造模后無任何干預措施）、穴位埋線組（造模后第2天行穴位埋線）每組16只。

免疫性葡萄膜炎（EAU）模型建立：Lewis大鼠在動物房飼養1周后在裂隙燈下排除眼部疾病，然后進行造模處理。參照文獻〔3-5〕方法按每只IRBP 100 μg、TB 100 μg、CFA 150 μl與PBS 150 μl充分混勻，制備乳糜液。麻醉后分別于雙后足墊及脊柱正中兩旁皮下共4個部位，共注射300 μl乳糜液，以誘導大鼠發生實驗性自身EAU。

埋線方法：（1）選穴：依據《實驗針灸學》及華興邦等所著大鼠穴位圖譜〔6，7〕脾俞，第12胸椎下兩旁；肋間，左右側各一穴；腎俞：第2腰椎下兩旁，左右側各一穴。（2）消毒：在超凈臺內選取穴位后，用醫用酒精消毒穴位及周圍皮膚。（3）進針：將1 cm羊腸線推入相應穴位皮下至肌層，線頭不外露，無菌棉簽按壓針孔處止血。每穴1針。

埋線后立即更換干燥清潔墊料。

1.3 觀察指標

大鼠眼部炎癥觀察；于造模后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23天分別對造模大鼠應用Genesis-D動物眼部照相機記錄眼前節變化，根據文獻〔8〕進行眼部炎癥評分，評分標準為0分：無炎癥；1分：虹膜血管輕/中度擴張充血、瞳孔縮小；2分：前房輕度混濁；3分：前房中度混濁，但仍可見瞳孔；4分：前房重度混濁、積膿、瞳孔膜閉、眼球前突。

大鼠眼球組織病理學觀察：造模后第9、13、18、23天麻醉，心臟取血，然后處死。隨機選取兩只大鼠摘取同側眼球，立即置于4%多聚甲醛中4℃固定48小時。經脫水、包埋、切片，常規HE染色。光學顯微鏡下觀察大鼠前房、虹膜、睫狀體炎性細胞浸潤情況及組織結構情況。

細胞學檢測：運用流式細胞儀檢測分析致病性抗原特異性T淋巴細胞中CD4+T、CD8+T所占比例。參照文獻〔4〕方法分離大鼠淋巴結T淋巴細胞，按照試劑說明書要求進行PE-CD8+、FITC-CD4+T細胞表面染色，立即行流式細胞儀檢測。

上述所有實驗獨立重復三次。

1.4 統計學方法

數據分析應用SPSS 17.0統計軟件包，組內不同時間點的比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

圖1～3 免疫后第13 d通過Genesis-D動物眼部照相機觀察大鼠眼前節炎癥情況。圖1空白組眼前部無炎癥改變；圖2穴位埋線組虹膜充血，瞳孔縮小并粘連；圖3造模組虹膜充血嚴重，瞳孔膜閉，前面大量滲出。

圖4～9 造模后第13 d大鼠虹膜（4、6、8）、睫狀體（5、7、9）組織病理學（HE，×200）。圖4～5為空白組虹膜，睫狀體，未見明顯變化；圖6～7分別為造模組虹膜，睫狀體，有大量炎性細胞聚集，虹膜、睫狀體有粘連；圖8～9分別為穴位埋線組虹膜，睫狀體，炎性細胞較造模組少，但仍可見，其中虹膜、睫狀體未見粘連。

2 結果

2.1 大鼠眼部炎癥表現

Genesis-D動物眼部照相機觀察發現：空白對照組眼部無炎癥改變（圖1）。穴位埋線組第8～9 d開始出現輕微眼部炎癥，第13 d眼部炎癥反應較重（臨床評分為2.17±0.68），虹膜充血嚴重，房水混濁，瞳孔縮小并粘連（圖2）；模型組于第6～7 d開始出現輕度眼部炎癥，表現為虹膜血管輕度擴張充血，瞳孔無明顯變化；第13 d為眼部炎癥的高峰期（臨床評分為3.42±0.58），虹膜充血嚴重，前房大量纖維素樣滲出，瞳孔膜閉，眼球前凸（圖3），隨后眼部炎癥逐漸消退。第13 d埋線組與模型組臨床癥狀得分比較，P＜0.05，差異有統計學意義。

2.2 大鼠眼前節組織病理學改變

眼球組織病理切片顯示造模后第13 d炎癥反應最重。空白對照組未發現炎性細胞浸潤，虹膜、睫狀體未發現組織形態學上的改變（圖4）；模型組（圖5）大鼠眼前房有大量炎性細胞聚集，虹膜、睫狀體有黏連，同時發現炎性細胞浸潤嚴重，如中性粒細胞、淋巴細胞等；穴位埋線組虹膜、睫狀體未發生粘連，眼前節炎性細胞浸潤比模型組癥狀輕（圖6）。

2.3 T淋巴細胞中CD4+T、CD8+T所占比例變化情況

淋巴結組織提取T細胞后流式細胞儀檢測發現，模型組和穴位埋線組隨著病情發展，CD4+T、CD8+T占T細胞比例也相應發生改變。

CD4+T：實驗發現，造模8、13、18、23 d后，模型組CD4+T占T細胞百分比（%）分別為75.02±0.45，85.97±1.03，80.12±1.82，76.73±2.44；穴位埋線組CD4+T占T細胞百分比（%）分別為73.06±0.85，79.51±0.64，74.79±1.05，73.50±0.70，模型組與穴位埋線組相應時間點比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），但空白對照組各時間點變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。第13天為炎癥高峰期，CD4+值占T細胞百分比最高，其中模型組高于穴位埋線組（圖10-A）。隨著炎癥消退，CD4+T占總T細胞百分比逐漸變小。

CD8+T：造模后8、13、18、23 d，模型組中CD8+T占T細胞百分比分別為24.98±0.44，14.03±1.03，19.88±1.82，23.27±2.44；穴位埋線組分別為26.94± 0.64，20.49±0.64，25.21±1.05，26.50+0.70，P＜0.05，兩組差異有統計學意義（表1）。第13天炎癥高峰期時CD8+值最低，且模型組低于穴位埋線組（圖10-B），隨著炎癥消退其值也逐漸增大，但空白對照組各時間點變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。在23天時模型組CD4+/CD8+與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），說明模型組炎癥基本消退；但我們發現穴位埋線組與對照組相比P＜0.05，說明埋線在23 d時可能存在免疫負反饋的作用。

圖10 13d時流式細胞儀檢測FITC-CD4+、PE-CD8+所占比例。A1為造模組FITC-CD4+所占比例，A2為造模組PE-CD8+所占比例。B1為穴位埋線組FITC-CD4+所占比例，B2為穴位埋線組PE-CD8+所占比例。

表1 不同時間點三組大鼠淋巴結T淋巴細胞CD4+T、CD8+T百分比（%）

3 討論

研究表明，針灸對慢性炎癥性疾病具有雙向調節作用，對炎性因子具有良好的調控作用，能使過低或過強的免疫功能恢復到正常水平〔9〕。穴位埋線是在基于傳統針灸以及穴位注射的基礎上改進而成，通過特殊的針具將可吸收的羊腸線埋入穴位內，從而產生一種生物化學反應，其同樣具有免疫調節作用。崔謹等〔10〕認為埋植于體內的羊腸線是一種異體蛋白，如同異種組織移植，其中的抗原可使人體淋巴細胞致敏，致敏細胞又配合體液中的抗體、巨噬細胞等反應來破壞、軟化、分解、液化羊腸線，使之變為多肽、氨基酸，最后被吞噬、吸收，同時產生多種淋巴因子。這些抗原刺激對穴位產生的生物化學刺激，使局部組織產生無菌性炎癥，甚至出現全身反應，從而提高人體的應激能力，激發人體免疫功能，調節身體有關臟腑器官功能，使活動趨于平衡。張利眾等〔11〕以背俞埋線為主配合叩刺華佗夾脊穴治療系統性紅斑狼瘡（SLE）38例，總療程1年，最初以原劑量服用激素，病情緩解后按常規撤減激素，結果顯效17例，有效15例，無效5例，總有效率84.2%，在臨床中取得了較好的效果。高德榮等〔12〕選用穴位埋線治療類風濕關節炎2 039例，近期治愈571例，顯效795例，好轉632例，無效41例，總有效率為98%。其中埋線前服用激素治療的有1692例，埋線后停服者1582例，占93%。本實驗通過對EAU大鼠模型眼前節炎性反應觀察，發現在第13天時前房炎癥反應最重，但穴位埋線組炎癥明顯低于模型組，與張利眾、高德榮等的臨床觀察結果相符。此結果表明穴位埋線可有效減輕葡萄膜炎的炎癥反應，故該療法對葡萄膜炎具有積極的治療作用。

淋巴細胞主要包括T淋巴細胞（CD3+），B淋巴細胞（CD19+），NK（CD16+、CD56+）。成熟T淋巴細胞根據其表面標志及功能的不同分為輔助/誘導T淋巴細胞（CD3+、CD4+）、抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+、CD8+）兩大亞群。其中輔助/誘導T淋巴細胞主要的表面標志是CD4+，抑制/細胞毒T淋巴細胞主要的表面標志是CD8+。在正常情況下，這兩大亞群保持一定的數量及比例以維持正常的免疫功能，當機體發生免疫性相關疾病時其平衡受到破壞。葡萄膜炎患者的臨床觀察研究發現其病理變化與免疫功能變化密切相關，尤其是T淋巴細胞比例的變化。張馨等〔2〕將穴位埋線用于慢性葡萄膜炎的治療，發現穴位埋線聯合藥物治療對慢性葡萄膜炎患者的輔助/誘導T細胞（CD4+）的降低比單純藥物治療的明顯，相對的抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD8+）則升高的明顯。詹宇堅等〔13〕研究了44例葡萄膜炎患者不同T淋巴細胞亞群的比例，發現CD4+細胞百分比升高和CD4+/CD8+值升高，而CD8+細胞比例下降，治療后上述表現均有改善。蘇衛華〔14〕在EAU大鼠模型動物實驗中得出眼用凝膠穴位埋線組脾臟和淋巴節培養細胞中CD4+，CD4+/CD8+比值比造模組低，CD8+升高。我們研究發現在第8、第13、第18、第23天四個時間點中，CD4+在炎癥初期其值逐漸變大，炎癥后期其值逐漸變小，第13天炎癥高峰期值最高，其中造模組高于穴位埋線組；CD8+在炎癥初期其值逐漸變小，在炎癥后期其值逐漸增大，第13天炎癥高峰期值最低，其中造模組低于穴位埋線組，其值的動態變化與T淋巴細胞在免疫系統疾病的調節密切相關，證明穴位埋線能有效調節自身免疫性葡萄膜炎動物模型中T淋巴細胞的變化。

綜上所述，穴位埋線可有效減輕EAU大鼠模型的炎癥癥狀，減輕眼前節的病理變化，降低CD4+T淋巴細胞及CD4+/CD8+T淋巴細胞的比值，促進CD8+T淋巴細胞的活化表達。但穴位埋線對后極部視網膜的病理變化的影響及對T淋巴細胞亞群的具體調節作用機制以及對二者之間的相互關系的影響有待進一步研究。

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Therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis

ZHENG Fengming，HAO Xiaobo，ZHAO Jianying，et al.Postgraduate Student，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530000，Guangxi，China

OBJECTIVE To explore the therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis（EAU）.METHODS Forty-eight liwes rat were randomly divided into control group，model group，treatment group with 16 rats each.Control and treatment groups were immunized by IRBP，CFA，TB，the treatment group in second days after immunie by catgut implantation，All groups was collected blood and isolated lymphocyte after 9，13，18，23 days，and then analyzed by flow cytometry.Further inflammation symptom was observed and confirmed by histopathologic examination in eye.RESULTS Uveitis inflammation was observed on day 6 or 7 and the severity peaked on day13 post immunization（Clinical mean score：EAU group 3.42±0.58，Catgut group 2.17± 0.68）and there was statistically significant differences（P=0.000）.After then the inflammation gradually subsided. Meanwhile，the morphologic change of organizational structure of iris and ciliary body also showed significant differences between EAU group and catgut group on days 9，13，18，23.But there was no inflammatory cell with the iris and ciliary body on control group.The flow cytometry showed that CD4 T was the highest in T cells on day 13.EAU group：85.97±1.03，catgut group：79.51±0.64；CD8 T was the lowest in T cells on day 13.EAU group：14.03± 1.03，catgut group：20.49±0.64，and there was statisti cally significant differences（P=0.000）.COUCLUSIONS The morphologic change of organizational structure on eye，the flow cytometry，the histopathologyshowed that there was a certain therapeutic effect of catgut implantation at acupoint on rats with experimental autoimmune uveitis.

catgut implantation at acupoint；experimental autoimmune；uveitis；flow cytometry；histopathology

R773

A

1002-4379（2015）05-0309-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.001

1國家自然科學基金（81360558）

2山東省中醫藥科技發展計劃項目（編號：2013ZDZK-083）

1廣西中醫藥大學，南寧530000

2廣西中醫藥大學第一附屬醫院

3山東中醫藥大學

4山東中醫藥大學眼科研究所

通迅作者：郝小波，E-mail：562695922@qq.com