消銀解毒飲通過cdc7抑制角質細胞增殖作用的動物實驗研究

韓 露 周 揚 段行武 陳 兵 方如男 李建紅

北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現的慢性炎癥性皮膚病，其特征性病理改變為持續性炎癥以及角質形成細胞(keratinocytes，KCs)增殖失控和分化障礙[1]。銀屑病皮損組織中KCs的增殖速度是正常表皮的2倍，而其細胞周期縮短到正常周期的1/8[2]，可見KCs的異常增殖與細胞周期紊亂密切相關。細胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein，cdc)7是細胞周期中最重要的調節因子之一，TAK-931則是一種cdc7選擇性抑制劑，具有顯著的抗增殖活性[3]。盡管目前沒有cdc7與銀屑病發病的相關報道，但有皮膚腫瘤方面的研究顯示cdc7在黑素瘤組織中高表達，而TAK-931可有效抑制黑素瘤進展[4]，提示我們cdc7在皮膚組織中發揮重要作用，且與表皮角質細胞增殖密切相關。銀屑病是KCs過度增生性疾病，我們先期的預實驗也發現，在銀屑病體內外模型中cdc7呈過度表達，提示 cdc7可能與銀屑病 KCs 異常增殖之間有密切聯系。

消銀解毒飲根據東直門醫院金起鳳教授創立的經驗方“消銀解毒湯”研制，臨床應用多年，治療銀屑病血熱證療效確切[5]。先期研究顯示消銀解毒飲可以通過抑制KCs增殖治療銀屑病[6,7]，然而其抑制KCs增殖的作用是否通過對細胞周期的調控仍需進一步研究。本實驗擬建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導的小鼠銀屑病模型，觀測用藥前后小鼠銀屑病皮損表現、表皮病理改變、皮膚組織cdc7表達情況，從動物實驗水平探討消銀解毒飲通過cdc7抑制角質細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性BALB/c小鼠20只，8周齡，體重20 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼) 2020-0001。

1.2 藥物 院內制劑消銀解毒飲(水牛角30 g，生地15 g，丹皮12 g，土茯苓30 g，苦參10 g，紫草15 g，生甘草6 g等)由北京中醫藥大學東直門醫院顆粒藥房提供。按照小鼠劑量(20 g體重)=9.1×成人劑量(70 kg體重)，得到小鼠灌胃劑量為23.4 g/kg，雙蒸水溶解，4℃保存備用。

1.3 試劑 cdc7抑制劑TAK-931(MCE，貨號：HY-100888)；5%咪喹莫特乳膏(明欣藥業，貨號：74969)；異氟烷(瑞沃德，貨號：217180101)；蘇木素(Sigma，貨號：H9627)；伊紅Y(水溶性)(國藥集團，貨號：71014544)；無水乙醇(國藥集團，貨號：10009218)；二甲苯(國藥集團，貨號：10023418)；包埋石蠟(國藥集團，貨號：69019361)；中性樹膠(國藥集團，貨號：10004160)；正常山羊血清(博士德生物，貨號：15GO6AC9)；Dako免疫組化試劑盒(安捷倫，貨號：K5007)；重組Anti-CDC7抗體(abcam，貨號：ab229187)。

1.4 儀器 病理切片機(德國Leica，型號：RM 2016)；脫水機(武漢俊杰，型號：JT-12J)；組織攤烤片機(武漢俊杰，型號：JK-6)；顯微鏡(奧林巴斯，型號：BX53)。

1.5 分組及造模

1.5.1 建立動物模型[8，9]將20只小鼠適應性飼養7天后，隨機分為4組，每組5只：①對照組；②銀屑病模型組；③消銀解毒飲組；④TAK-931組。實驗前所有小鼠予異氟烷吸入麻醉，除去背部毛發，形成約2 cm×3 cm皮膚暴露區域。②③④組每只小鼠每日涂抹含5% IMQ的膏霜50 mg，①組小鼠只進行等量凡士林涂抹處理，連續涂抹5天。

1.5.2 實驗給藥 ①②組小鼠蒸餾水灌胃；③組每天進行消銀解毒飲灌胃處理(每次23.4 g/kg)；④組每天進行TAK-931灌胃處理(每次2 mg/kg)。所有動物給藥容量是每次10 mL/kg，每天2次，造模當天開始給藥，連續5天。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 小鼠銀屑病皮損面積和嚴重程度評估 第1～5天涂抹IMQ前及第6天，每天對小鼠背部皮膚暴露區域進行單獨拍照處理，動態觀察皮損進展情況，依據銀屑病皮損面積與嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評價辦法[10]，對小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度進行評分，評分標準為：0分(無)；1分(輕度)；2分(中度)；3分(重度)；4分(極重度)。將三者相加得到總積分，對各組小鼠的總積分取均值后繪制趨勢圖。

1.6.2 HE染色觀察小鼠皮膚組織形態學改變 于造模第6天，處死小鼠取其背部皮膚組織，經脫水、透明處理后，進行石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。切片脫蠟，入蘇木素染液染色5 min，沖洗后入1%水溶性伊紅染液染色5 min，以中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像，觀察各組小鼠皮膚組織病理學變化，并采用ImageJ軟件測量表皮厚度。

1.6.3 免疫組化檢測小鼠皮膚組織中cdc7表達 皮膚組織切片脫蠟、水化、抗原修復后，滴加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，以正常山羊血清封閉30 min，cdc7抗體(1∶100)4℃孵育過夜，酶標二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水后以中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像，檢測各組小鼠皮膚組織cdc7表達情況。

1.7 統計學方法 采用GraphPad prism軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，PASI評分采用秩和檢驗(Kruskal-wallis)進行組間比較，表皮厚度、cdc7陽性細胞計數采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD進行比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚的影響 從每日皮損變化觀察得到，對照組小鼠皮膚無紅斑、無鱗屑、無增厚改變；造模后小鼠皮膚逐漸出現紅斑，且皮膚不斷增厚，第3天出現鱗屑表征，第6天時，背部皮膚紅斑明顯，布滿層狀鱗屑，易脫落，皮膚高度增厚；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損進展較慢，鱗屑明顯減少，紅斑面積較小、顏色較淡，皮損肥厚程度不明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠背部皮損表現

PASI評分結果表明，與對照組相比，模型組小鼠第2天起即有皮膚增厚表現，隨抹藥天數的增加，總評分呈上升趨勢，表明皮損不斷加重，其中第2～3天及第4～5天評分上升幅度最大；與模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組總評分明顯減低，增高速度緩慢，表明消銀解毒飲組與TAK-931組皮損進展較慢，紅斑、鱗屑、皮損增厚程度較輕，見圖2。

圖2 各組小鼠皮損PASI評分

2.2 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚組織形態學影響 HE染色結果顯示，對照組小鼠表皮層薄，無增厚改變，細胞浸潤少；銀屑病模型組小鼠表皮增生明顯，同時存在角化過度與角化不全，棘細胞層增厚，角質層可見Munro微膿腫，真皮層有大量炎性細胞浸潤；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損區域表皮增生較輕，真皮層炎性細胞數目較少，見圖3。

3a：對照組；3b銀屑病模型組；3c消銀解毒飲組；3d：TAK-931組；黑色箭頭：表皮增生；藍色箭頭：炎性細胞浸潤(HE，×200)

使用ImageJ軟件測量HE染色后各組表皮厚度，銀屑病模型組明顯較對照組表皮增厚(P<0.01)，消銀解毒飲組(P<0.01)和TAK-931組(P<0.05)表皮增厚程度均低于模型組，其中消銀解毒飲組對表皮增生的改善作用更明顯,但二組相比差異無統計學意義，見圖4。

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

2.3 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚組織中cdc7表達的影響 免疫組化檢測結果顯示，對照組表皮較少見cdc7陽性細胞；與對照組相比，模型組表皮cdc7陽性細胞顯著增多(P<0.01)，主要分布于基底層，棘層亦有分布；消銀解毒飲組表皮cdc7陽性細胞數較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖5、6。

5a：對照組；5b：銀屑病模型組；5c：消銀解毒飲組

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

3 討論

銀屑病的發病機制尚不清楚，目前較為公認的發病模型認為，當皮膚感染或損傷時，角質細胞釋放抗菌肽并與自身遺傳物質相結合，激活樹突狀細胞，產生TNF-α、IL-23等細胞因子，介導Th17細胞的分化。成熟的Th17細胞分泌IL-17、IL-22、IL-23等炎性反應因子激活KCs的增殖。KCs過度增殖又分泌多種細胞因子、趨化因子和抗菌肽等物質趨化Th17等炎癥細胞至皮膚，從而形成了促進銀屑病發生發展的正反饋環路[11,12]。由此可見，KCs過度增殖在銀屑病的發生和維持中都起重要作用。

cdc7是細胞周期中必需的一種激酶，特別調節細胞周期的G1/S相變，而G1/S相變是細胞增殖的基礎。cdc7在與其調節亞基DBF4結合后形成活性激酶復合體(DBF4-dependent kinase，DDK)，使其下游效應分子微小染色體效應維持蛋白(mini chromosome maintenance protein，MCM)2-7磷酸化，從而激活解旋酶活性，開啟DNA復制的第一步[3,13]。而KCs的異常增殖與細胞周期紊亂密切相關[2]，依此推測cdc7對細胞周期DNA復制起始的調控可能參與銀屑病KCs異常增殖的病理過程。

在本次研究中，與對照組相比模型組小鼠皮膚經IMQ誘導后出現紅斑、鱗屑、皮膚增厚改變，同時HE染色觀察小鼠皮損組織形態學變化，發現模型組小鼠表皮增生明顯，棘細胞層增厚，真皮層有炎性細胞浸潤，以上均符合銀屑病臨床及病理表現。在應用cdc7抑制劑TAK-931后，對小鼠皮損PASI評分有較為明顯的改善作用，HE染色結果顯示，TAK-931可以減輕銀屑病模型表皮增生程度，減輕炎癥細胞浸潤。說明cdc7對細胞周期的調控作用可以促進銀屑病KCs的異常增殖，通過抑制cdc7可以有效干預小鼠銀屑病模型進展。

我院制劑消銀解毒飲由水牛角、生地、牡丹皮、赤芍、金銀花等藥物組成，有涼血清熱、解毒化斑、泄濕止癢的作用，臨床研究顯示，其治療銀屑病血熱證的總有效率為91.8%，療效確切[5]。我科前期研究采用藥理血清的方法，以角質形成細胞株 COLO-16為研究對象，觀察消銀解毒飲及拆方后各組藥物血清對KCs增殖的影響，發現消銀解毒飲可直接抑制KCs過度增殖以及誘導其凋亡，并且可以抑制角質形成細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)，從而發揮對銀屑病的治療作用[6,7,14]。本研究使用消銀解毒飲干預小鼠銀屑病模型，發現消銀解毒飲可以明顯改善小鼠皮損PASI評分及組織病理形態學表現；免疫組化法檢測結果顯示，消銀解毒飲可以顯著降低小鼠銀屑病模型表皮cdc7陽性細胞的水平。

綜上所述，cdc7可以促進銀屑病KCs的異常增殖，消銀解毒飲可能通過下調cdc7表達，抑制KCs的過度增殖，發揮對銀屑病的治療作用。然而，本研究尚處于消銀解毒飲通過cdc7抑制角質細胞增殖研究的初級階段，關于其作用機制尤其是具體信號通路的具體調控過程仍亟待進一步闡明。