蝦頭蛋白酶解對(duì)熱反應(yīng)型蝦味香精風(fēng)味特征的影響*

李冬梅，李歡，李世偉，孫彤，董志儉，勵(lì)建榮

1(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)2(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州，225300)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國(guó)對(duì)蝦蝦頭凍干粉，實(shí)驗(yàn)室自制;風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)，500 LAPU/g，諾維信公司;復(fù)合蛋白酶(Protamex)，1.5 AU/g，諾維信公司;堿性蛋白酶(Alkaline protease)，200 u/mg，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司;木瓜蛋白酶(Papain)，100 u/mg，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;中性蛋白酶(Neutral protease)，200 u/mg，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司;木糖，食品級(jí)。

PB-10 pH計(jì)，賽多利斯公司;賽康BL301B3絞肉機(jī)，上海賽康電器有限公司;油浴鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;固相微萃取裝置，美國(guó)Supelco公司;SPME萃取頭(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex 2cm);氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司(7890A，5975C);氨基酸分析儀L-8900，日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中國(guó)蝦頭蛋白水解產(chǎn)物的制備

1.2.1.1 樣品前處理方法

將中國(guó)對(duì)蝦蝦頭清洗干凈，經(jīng)冷凍干燥后絞碎，即為蝦頭凍干粉，抽真空密封后于0℃保存待用。

1.2.1.2 水解液的制備

準(zhǔn)確稱取樣品按水料質(zhì)量比4∶1加水后，加入底物質(zhì)量2.5%的蛋白酶。調(diào)節(jié)體系初始pH到各蛋白酶的最適 pH(Flavorzyme pH 6.5，Papain pH 6.5，Alkaline protease pH 8.0，Neutral protease pH 6.5，Protamex pH 6.0)，置于各蛋白酶最適溫度下酶解，于80℃滅酶5 min，5 000 r/min離心10 min后取上清液定容即得。

1.2.1.3 蝦頭蛋白水解度的測(cè)定

(1)總氮的測(cè)定:自動(dòng)凱氏定氮法，經(jīng)3次測(cè)定求平均值，求得總氮含量(X0)。

(2)氨基態(tài)氮的測(cè)定:甲醛電位滴定法［4］。

(3)水解度的計(jì)算:DH/%=X/X0×100。X為酶解液中氨基氮質(zhì)量;X0為樣品中總氮質(zhì)量。

1.2.1.4 多肽含量的測(cè)定［6］

雙縮脲試劑:A液，0.1 g/mL NaOH溶液;B液，0.01 g/mL CuSO4溶液。取2.5 mL經(jīng)1倍稀釋的水解液，加2.5 mL 10%的三氯乙酸混勻，靜置10 min，在5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL測(cè)定，加4 mL 0.1g/mL NaOH溶液混勻后，加3 mL CuSO4混勻，室溫靜置30 min，于540 nm處比色，并用蒸餾水做對(duì)照。

1.2.2 游離氨基酸含量測(cè)定

將待測(cè)樣品經(jīng)等體積的10%磺基水楊酸溶液沉淀蛋白后，14 000 r/min離心15 min，稀釋到適當(dāng)濃度后，再用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾，通過(guò)L-8900氨基酸分析儀分析其氨基酸含量。

1.2.3 蝦頭蛋白水解液MPRs的制備

稱取5%的木糖于水解4 h的各蛋白酶水解液中并攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.8，封口，于115℃的油浴鍋中反應(yīng)20 min后取出，迅速于冰浴中冷卻備用。

1.2.4 蝦頭蛋白水解液MPRs揮發(fā)性成分測(cè)定

在20 mL的樣品瓶中裝入5 mL蝦頭蛋白水解液MPRs，將頂空瓶放入50℃恒溫水浴中平衡20 min，再將已老化好的SPME針頭插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭暴露到頂空氣體中萃取30 min后，用手柄使纖維頭推回到針頭內(nèi);拔出針頭，將吸附了分析組分的萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣器中，使待測(cè)組分解吸，進(jìn)入GC-MS進(jìn)行分離與分析。

1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析

1.2.5.1 氣相色譜條件

柱子型號(hào):VF-5 ms，30m ×0.25 mm ×0.25 μm;柱溫:初始溫度40℃ 4 min，升溫速率5℃/min，終溫240℃ 5 min;進(jìn)樣口溫度:250℃;柱流速:1.0 mL/min;載氣:He(99.999%)。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

掃描范圍:采集的質(zhì)量范圍30～550 amu;傳輸溫度:280℃;四級(jí)桿溫度:220℃。

1.2.5.3 揮發(fā)性化合物的鑒定

根據(jù)GC-MS分析對(duì)蝦頭蛋白水解液MRPs中揮發(fā)性化合物鑒定，將分離出的化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)相匹配。

1.2.5.4 揮發(fā)性化合物相對(duì)含量的確定

采用峰面積歸一化法

1.2.6 感官評(píng)定

通過(guò)添加0.5%的NaCl評(píng)價(jià)MRPs的風(fēng)味特征，同時(shí)以0.5%的NaCl溶液作為對(duì)照溶液，60℃恒溫水浴恒溫10 min，進(jìn)行感官評(píng)定。打分采用7分制，將0.5%的NaCl溶液設(shè)定為3分，分值越大表明作用效果越強(qiáng)。感官評(píng)定小組由6位感官經(jīng)驗(yàn)較豐富的評(píng)定人員(3男3女)分別對(duì)各感官指標(biāo)(鮮味、醇厚味、持續(xù)感和焦甜味)進(jìn)行評(píng)分。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦頭蛋白水解過(guò)程中蛋白水解度變化

由圖1可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，5種蛋白酶對(duì)中國(guó)對(duì)蝦蝦頭蛋白的水解度都呈逐漸升高的趨勢(shì)，但每種蛋白酶對(duì)蝦頭蛋白的水解能力各不相同。其中Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease在水解蝦頭蛋白過(guò)程中的水解度相對(duì)較高，Protamex雖然在初期的水解度很低，但3 h后水解度有較大提高，Papain對(duì)蝦頭蛋白水解能力較差，不適合蝦頭蛋白的水解。

圖1 蝦頭蛋白水解過(guò)程中水解度變化Fig.1 Change of hydrolysis degrees during the hydrolysis of shrimp head protein

2.2 蝦頭蛋白水解過(guò)程中多肽含量變化

圖2是不同蛋白酶水解蝦頭蛋白過(guò)程中多肽含量變化。由圖2可知，5種蛋白酶水解液中多肽含量在水解過(guò)程中都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);李艷紅［6］在利用排阻色譜法研究鷹嘴豆蛋白酶解物的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著水解程度的加深，酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布總體表現(xiàn)為大分子質(zhì)量肽含量逐漸減少，小分子量肽含量逐漸增多，隨后，小分子質(zhì)量肽段被進(jìn)一步水解成分子質(zhì)量更小的肽段或氨基酸，因此，酶解物中多肽含量在水解后期有所下降。然而，不同蛋白酶水解蝦頭蛋白過(guò)程中多肽含量變化各有特點(diǎn):Protamex和Papain水解液中多肽含量相對(duì)較高，而Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease水解液中多肽含量較低。結(jié)合圖1和圖2可知，Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease對(duì)蝦頭蛋白的水解程度較大，但水解液以氨基酸為主，多肽含量較低;Papain水解液中多肽含量雖然較高，但其對(duì)蝦頭蛋白的水解程度較弱;與以上4種蛋白酶相比，Protamex對(duì)蝦頭蛋白具有較好的水解能力，同時(shí)水解液中多肽含量相對(duì)較高。

圖2 蝦頭蛋白水解過(guò)程中多肽含量變化Fig.2 Change of peptide contents during the hydrolysis of shrimp head protein

2.3 蝦頭蛋白水解液Maillard反應(yīng)前后氨基酸組成變化

表1是蝦頭蛋白水解液Maillard反應(yīng)前后氨基酸組成變化分析結(jié)果。其中Alkaline protease水解液中氨基酸總含量最高，其次是Neutral protease、Protamex和Flavorzyme水解液，而Papain水解液中氨基酸總含量最低。5種蛋白酶水解液中氨基酸總含量在Maillard反應(yīng)后均有所降低，消耗量最大的氨基酸主要有半胱氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸。圖3是不同蛋白酶水解液Maillard反應(yīng)過(guò)程中鮮味氨基酸和含硫氨基酸的消耗量;Protamex水解液中鮮味氨基酸的總消耗量為負(fù)值，說(shuō)明Maillard反應(yīng)過(guò)程中由多肽降解產(chǎn)生的鮮味氨基酸與原有鮮味氨基酸的總含量大于反應(yīng)過(guò)程中消耗的鮮味氨基酸含量，這對(duì)MRPs的鮮味貢獻(xiàn)作用較大;而其他4種蛋白酶水解液中鮮味氨基酸消耗量主要為正值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7］，含硫氨基酸的消耗對(duì)MRPs的肉香香氣貢獻(xiàn)較大;由圖3也可看出，5種蛋白酶水解液中含硫氨基酸的消耗量都為正值，這說(shuō)明Maillard反應(yīng)促使水解液中的含硫氨基酸生成呈香物質(zhì)。總的來(lái)看，各水解液中必需氨基酸含量變化不大。

表1 蛋白酶水解液及其MRPs中氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein hydrolysates and their MRPs

2.4 不同蛋白酶水解液MRPs揮發(fā)性成分分析

由圖4可以看出，Protamex水解液MRPs中檢測(cè)出的含氮雜環(huán)化合物、含硫化合物和含氧雜環(huán)化合物的含量都較高，其中含氮雜環(huán)化合物2，5-二甲基吡嗪相對(duì)含量達(dá)到5.58%(見(jiàn)表2)，該化合物具有烤香味和堅(jiān)果香味［8－9］，含硫化合物二甲基二硫和二甲基三硫的相對(duì)含量分別為5.63%和3.21%(見(jiàn)表2)，這兩種化合物通常具有特征的烤肉香氣、堅(jiān)果氣味及洋蔥氣味，對(duì)蝦香味和肉香味具有重要貢獻(xiàn)［2，10］;Alkaline protease 水解液 MRPs中含氮雜環(huán)化合物和含硫化合物含量也較高，其中檢測(cè)出的2-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、二甲基二硫和二甲基三硫的含量分別為2.50%、6.38%、4.52%和2.35%(見(jiàn)表2)，使其Maillard產(chǎn)物具有較強(qiáng)的烤肉特征風(fēng)味;對(duì)于Neutral protease來(lái)說(shuō)，其MRPs中含氮雜環(huán)化合物與酮類化合物含量較高，檢測(cè)出的2，3-辛二酮具有奶香味和果甜香味，常用于做焙烤香精［11］;同時(shí)檢測(cè)出的2，5-二甲基吡嗪和嘧啶使其燒烤的特征風(fēng)味明顯;而Papain和Flavorzyme水解液MRPs中檢測(cè)出的含氮、氧雜環(huán)化合物、含硫化合物和酮類化合物的含量都相對(duì)較低，其特征風(fēng)味較不明顯。由此可以看出，酶的種類不同，其各自的MRPs揮發(fā)性特征成分具有較大差異，這與水解產(chǎn)物中氨基酸與多肽的組成與含量有較大關(guān)系;據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白水解液MPRs揮發(fā)性成分的形成主要取決于水解液中氨基酸組成、多肽分子質(zhì)量分布及肽的構(gòu)成方式等［12］，分子質(zhì)量在1 000～5 000 Da的多肽在美拉德反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的肉香味［13］，隨著游離氨基酸和小分子質(zhì)量寡肽的增多，美拉德反應(yīng)后生成的吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)增多，醛類物質(zhì)的種類減少［14］;而蛋白酶的種類是影響蛋白水解液中多肽結(jié)構(gòu)和氨基酸組成不同的主要因素之一。

圖4 不同蛋白水解液MRPs中特征風(fēng)味化合物Fig.4 Characteristic flavor compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

2.5 不同蛋白酶水解液MRPs的感官評(píng)價(jià)

圖5為5種蛋白酶水解液MRPs的感官評(píng)定結(jié)果。5種MRPs主要呈鮮味、醇厚味和焦甜味，持續(xù)感較強(qiáng)，酸味和苦味較淡。其中，焦甜味、酸味和苦味差別不大;FM鮮味稍強(qiáng)，但持續(xù)感和醇厚味較差;PaM持續(xù)感和醇厚味一般，但鮮味較差;NM無(wú)論是鮮味、持續(xù)感還是醇厚味都相對(duì)較差;AM具有較強(qiáng)的鮮味，但其持續(xù)感和醇厚味相對(duì)較差;PrM的鮮味、持續(xù)感和醇厚味都相對(duì)較強(qiáng)。Protamex水解液在Maillard反應(yīng)過(guò)程中，其鮮味氨基酸含量增加(見(jiàn)圖4)，因此，其PrM在感官評(píng)定中呈現(xiàn)較強(qiáng)的鮮味;而鮮味、持續(xù)感和醇厚味可歸因于水解液中的呈鮮味或有鮮味增強(qiáng)作用的小肽類物質(zhì)，這些肽類物質(zhì)在發(fā)生美拉德反應(yīng)后可使體系中的鮮味、持續(xù)感和醇厚味明顯增強(qiáng)［15］。

圖5 不同蛋白水解液MRPs感官評(píng)定Fig.5 Sensory evaluation of MRPs derived from different protein hydrolysates

3 結(jié)論

(1)隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，5種蛋白酶對(duì)中國(guó)對(duì)蝦蝦頭蛋白的水解程度逐漸加深，氨基酸含量逐漸增大，多肽含量先升高后降低。其各自水解產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)后，游離氨基酸含量普遍降低，MRPs揮發(fā)性特征成分具有較大差異，其感官滋味強(qiáng)弱不同，主要呈鮮味、醇厚味和焦甜味，持續(xù)感較強(qiáng)，酸味和苦味較淡。

(2)Protamex水解液中多肽和游離氨基酸含量都相對(duì)較高，其MRPs具有較強(qiáng)的肉香味、海鮮味和烤肉香味等特征風(fēng)味，鮮味氨基酸含量有所升高，其鮮味、持續(xù)感和醇厚味等感官滋味都相對(duì)較強(qiáng)。因此，復(fù)合蛋白酶比較適合對(duì)蝦頭蛋白水解，并通過(guò)Maillard反應(yīng)進(jìn)一步制備鮮味肽或鮮味增強(qiáng)肽。

表2 不同蛋白水解液MRPs的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

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