海馬神經細胞網絡傳感器及其記錄5-HT對網絡活動的作用*

胡 靚，秦 臻，王 琴，李 蓉，王 平*

（1.浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生物醫學工程與儀器科學學院，杭州 310027；2.中科院傳感技術國家重點實驗室，上海 200050）

海馬神經細胞網絡傳感器及其記錄5-HT對網絡活動的作用*

胡 靚1，2，秦 臻1，王 琴1，李 蓉1，王 平1，2*

（1.浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生物醫學工程與儀器科學學院，杭州 310027；2.中科院傳感技術國家重點實驗室，上海 200050）

海馬神經網絡活動在調節記憶和學習等行為中具有重要作用，而五羥色胺是調節此類行為的重要神經遞質。目前，某些研究手段揭示了5-HT對海馬神經元活動的作用，但是這些手段并沒有直觀展示海馬神經元網絡的電生理活動。因此，為了研究5-HT在體外海馬神經元網絡活動中的作用，本實驗建立了微電極陣列（Microelectrode Array，MEA）的檢測平臺。利用60通道MEA芯片，可以實時無損地記錄5-HT作用前后的多位點信號，實驗結果證明5-HT對海馬神經元的動作電位有抑制作用，但是對低頻振蕩沒有明顯變化。該實驗表明，這種海馬神經元網絡傳感器可以對神經元進行無損、長時間的記錄。上述研究結果表明，這種新的細胞網絡傳感器有望成為神經元網絡活動研究中的一種重要手段。

生物傳感器；海馬神經元網絡；微電極陣列（MEA）；神經元網絡活動；5羥色胺；網絡振蕩

海馬神經元的生理活動在調節記憶和學習等行為上具有重要作用。研究表明，海馬神經元活動可以被某些神經遞質興奮或者抑制，進而產生不同的電生理發放模式。這些不同的發放模式可能代表大腦功能的不同處理階段［1-3］。還有研究表明，異常神經網絡活動如癲癇樣放電可能造成海馬神經網絡功能障礙，進而導致如Alzheimer癥等記憶受損癥［4-5］。因此非常有必要研究海馬神經網絡活動來了解更多大腦工作的方式。

另外，在上個世紀90年代，海馬神經元網絡作為傳感器敏感單元，已經被體外培養在微電極陣列表面來檢測一些毒素及化學物質。通過改變自發活動模式，神經元網絡能對大量具有神經活性的物質進行響應，且具有相當高的靈敏度［6-8］。研究結果表明，體外培養的神經元網絡可以保持電生理和藥理活性長達9個月，有利于進行長時程檢測。以神經元網絡作為敏感單元的生物傳感器在對藥物，毒素和氣味物質的檢測中具有良好表現。但是，以上研究中通常采用的是海馬組織或者神經元，對其所檢測的物質的信號傳導機理和編碼缺乏認識和研究，其網絡的特異性和功能性應用方面的研究也比較少。因此本實驗研究了體外神經元網絡中的信號傳導。

在哺乳動物神經系統中，5-HT是一種廣泛分布的神經遞質，參與調節人類情感，攝食等行為。5-HT受體主要分布于腦區，尤其是海馬區，皮層和基底神經節等區域［9］。幾乎所有的5-HT受體亞基都在海馬區表達，5-HT受體在海馬神經元中對神經元活動具有抑制性調節作用［10-11］，5-HT受體對海馬神經網絡振蕩也有調節作用［12-13］。因此不同于傳統的在體記錄方式［14］，本實驗采用體外多點記錄方式，對體外培養的海馬神經元網絡胞外電生理活動進行。該方法降低了海馬神經元網絡的復雜度，為研究細胞間信號傳播提供了簡便的檢測方法。

圖1 MEA芯片

本研究采用微陣列電極技術，建立了一個胞外電生理記錄平臺。這種方法可以實時無損地記錄神經元網絡多點信息，為研究體外神經元網絡活動提供了大量信息。同時，單個神經元的電生理活動也可以同時采集。在以往的研究中，我們已經將這種技術應用于生物組織例如嗅黏膜或嗅球切片的電生理記錄［15-16］。這種基于生物組織的復合傳感方式對刺激具有良好的靈敏度和特異性。而本實驗中，采用體外培養海馬神經元網絡的方式，相較于生物組織切片而言，降低了網絡的復雜度，便于實驗觀察和分析信號。

1 實驗方法

1.1 MEA芯片加工

采用標準微加工技術制備MEA芯片。首先，將一層30 nm鈦層和一層300 nm金層分別沉積到玻璃基底上，作為粘附層和電極層。采用光蝕刻技術蝕刻出電極位點和引線的布局。除去光刻膠后沉積一層1 μm Si3N4作為鈍化層，再用KOH暴露出電極和焊盤。將用金線將芯片上的焊盤和PCB上的接口連接，用環氧膠將細胞培養腔固定在芯片上（圖1（a））。

如圖1（b）所示，MEA芯片為8×8陣列排布。單個電極大小為20 μm，電極間距為150 μm。60個電極作為記錄電極。實驗前對電極表面電鍍鉑黑，采用交流阻抗譜評估鉑黑的效果。結果表明，電鍍鉑黑明顯降低低頻段阻抗（圖1（c））。該結果與基于MONTECARLO模型的結果一致，證明納米顆粒的沉積具有降低電極阻抗的作用，有利于提高性噪比［17］。

1.2 海馬神經元網絡的培養

選取出生1 d～2 d的SD乳鼠，斷頭取腦。取海馬組織剪碎后置于含有3 g/L滅火牛血清的HBSS溶液中，用0.25%胰酶消化15 min。用200孔/inch的細胞篩將分離的細胞加入含有10%滅火牛血清的DMEM制成懸浮液，隨后加入MEA培養腔中進行培養。細胞接種密度為104個/cm2。培養液每兩天更換一次，七天后初步形成海馬神經元網絡，便可以進行實驗。

1.3 MEA檢測神經元網絡電位

MEA檢測海馬神經元電位的原理圖如圖2所示。采用MEA-1060（Multi Channels Systems，Germany）采集放大系統進行實時記錄神經元電位信號。采樣率為10 kHz，Ag/AgCl電極作為參考電極。首先，記錄磷酸鹽酸緩沖液（PBS）中海馬神經元網絡的自發放電位10 min。然后移除PBS溶液，加入100 μM的5-HT溶液，檢測海馬神經元網絡在5-HT刺激下的響應。最后，洗脫5-HT溶液，換成PBS環境下檢測神經元網絡的發放。

1.4 數據處理

采用MC-Rack軟件記錄采集并放大后的60通道海馬神經元網絡發放電位。采用Butterworth帶通濾波器對原始信號進行濾波（100 Hz～300 Hz），觀察動作電位發放情況。對每個試驗階段（自發狀態，5-HT處理，5-HT洗脫）下60通道中記錄到神經點發放活動的通道數進行統計，作為活躍通道數，來評價5-HT的抑制作用。采用Clampfit對3個實驗階段的原始信號進行頻譜分析，觀察低頻狀態下的網絡振蕩狀態。

圖2 采用多位點電生理檢測平臺記錄5-HT對海馬神經元網絡活動的原理圖。

2 實驗結果

2.1 海馬神經元網絡的培養

圖3為在MEA芯片表面培養6 d所形成的神經元網絡。海馬神經元和膠質細胞能從軸突這個特征中很好的區分開來。海馬神經元具有兩極或三極的形狀，并和周圍的神經元通過突觸相連接。而膠質細胞作為支持細胞，沒有軸突的形成。

圖3 海馬神經元網絡和膠質細胞

2.2 海馬神經元網絡自發活動的特點

首先，根據電極的排布位置和實驗記錄的數據，得出了自發狀態下神經沖動傳導速度。通過發放模式特征和位置，同一個網絡中的不同神經元的信號被歸類出來；統計相鄰電極上記錄到信號的延時，除以電極間的距離，得到神經沖動傳導的速度。自發狀態下，神經沖動傳播速度大約為1.4 cm/s，而在無髓鞘神經纖維上神經沖動的傳播速率大約為20 cm/s～35 cm/s［18］。這主要是由于體外培養的神經元網絡在生理活性較低造成。且神經電興奮在突觸間傳播速度比在神經纖維上的傳導速度更低。其次，我們分析了自發狀態下海馬神經元網絡的振蕩特性。在實驗中可以觀察到大量的網絡同步振蕩活動（圖4（a）。通過頻譜分析發現主要為theta、alpha、beta振蕩（圖5）。

2.3 5-HT對海馬神經元網絡的抑制效應

為了研究5-HT對海馬神經元網絡的作用，實驗記錄了網絡對100 μM 5-HT的響應。在檢測到自發響應的海馬神經元網絡中加入5-HT進行刺激，神經元網絡活動（5次）表現出幾乎完全被抑制的現象。而將5-HT洗脫后，神經元的動作電位活動又迅速恢復（圖4（a）?；钴S通道數統計也證明了100 μM 5-HT的抑制作用（圖4（b）。

圖4 海馬神經元網絡活動在5-HT作用下的響應

高頻電生理信號體現了單個神經元的動作電位發放，而低頻的神經網絡振蕩則體現了神經元之間的相互作用。神經振蕩是中樞神經系統中存在的一種節律性，本實驗中的低頻神經振蕩屬于局部場電位，是由大量神經元同步發放引起的振蕩活動。圖5中頻譜分析結果顯示，神經網絡的振蕩頻率主要成分在theta和beta頻段，且在5-HT刺激前后振蕩頻率并沒有明顯改變。

圖5 低頻網絡振蕩頻率在5-HT作用前后無明顯變化

3 討論

本文通過結合體外培養海馬神經元網絡，建立了一個簡化的海馬神經元網絡，并分析了海馬神經元網絡響應信號的時域和空間特點。研究表明單個海馬神經元活動在不同頻段振蕩表明了神經元的一種內在能力，這種能力是協調網絡活動的基礎。在本研究中，單個海馬神經元的自發放頻率遠遠高于在體檢測的神經元發放頻率（低于1 spike/s）［19］。這種顯著差別可能來源于兩種檢測方式的差別。在體檢測中，微電極陣列植入海馬可能會引起神經組織的損傷，導致神經元活動的減弱。而離體的MEA芯片對神經元是無損的，可以進行長時程檢測。另外，貼附在MEA芯片表面的神經元比在體情況下神經元和電極的接觸更為緊密。體外培養的神經元網絡可能比在體的神經組織活動更為活躍。

實驗中海馬神經元的動作電位被5-HT幾乎完全抑制，這也與以往報道的結果一致。這個結果和文獻報道一致，即5-HT1A受體激動劑和5-HT自身都能抑制大鼠海馬區的神經元活動。這種抑制效應可以通過選擇性或非選擇性的5-HT1A受體拮抗劑阻斷。研究報道，5-HT能誘導海馬神經元超極化，并通過激活鉀通道來增加抑制性突觸后電位［20］。同時，5-HT通過與5-HT1A受體作用，能激發GABA能中間神經元，增加抑制性突出后電位的形成，從而降低神經元的發放活動［21］。

實驗中海馬神經元網絡出現了同步振蕩的電生理活動。同步振蕩是一種最基本的網絡活動，海馬神經元網絡的一個重要特征就是能產生有節律性的振動。本實驗中，theta，beta振蕩共同存在于海馬神經網絡振蕩中。同步的theta/beta網絡振蕩可能表明了未成熟的腦皮層形成早期功能性網絡的內源性能力。海馬神經網絡的振蕩頻率范圍可能對海馬神經信號的編碼解碼研究提供信息。5-HT對調節theta節律具有重要作用，而本實驗中直接對海馬神經元施加5-HT刺激，對并沒有明顯改變海馬神經網絡的振蕩頻率。目前具體的機制并不清楚，但是有多種可能的原因。首先，實驗中直接施加5-HT刺激于體外培養的神經元網絡，相比于以往的研究采用腹膜下注射等系統性輸入方式，也許缺乏某些能和5-HT作用來調節網絡振蕩的效應器。5-HT調節在體海馬theta振蕩主要是由于調節GABA能和膽堿能神經元的抑制/興奮平衡來影響網絡振蕩。而體外培養的神經元網絡振蕩可能缺乏與這些中間神經元的相互作用。另外，實驗中采用的體外培養的神經元網絡還處于網絡形成初期（7 d左右），神經元網絡的功能性連接可能還不成熟，因此對5-HT也無法響應。

4 結論

通過培養海馬通路神經元，構建了一種新的海馬細胞神經元網絡傳感器。實驗結果表明，多點記錄的MEA傳感器可以有效記錄海馬神經元網絡的胞外電位和振蕩活動，具有無損和長時程連續測量的優勢。另外，實驗結果證明，5-HT能抑制海馬神經元動作電位的方法，但是對體外培養的初級海馬神經元網絡振蕩頻率沒有明顯變化。在后續的研究中，我們將探索如何將海馬神經元更好地貼附于微電極表面上，以提高傳感器的穩定性，靈敏度和可重復性。在實驗室同事以前的工作中，采用共自組裝單體層（SAM）技術來修飾細胞傳感器的電極表面，提高了傳感器的生物相容性，并成功將細胞固定在目標位置［22］。另外，對于海馬神經元的生理特性，還可以采用其他手段進行多參數觀測，如熒光探針技術［23］，電化學阻抗［24］，膜片鉗傳感器［25］等。

［1］ Izquierdo I，Medina J H.Memory Formation：The Sequence of Biochemical Events in the Hippocampus and Its Connection to Activity in other Brain Structures［J］.Neurobiology of Learning and Memory，1997，68（3）：285-316.

［2］ Heynen A J，Quinlan E M，Bae D C，et al.Bidirectional，Activity-Dependent Regulation of Glutamate Receptors in the Adult Hippocampus in vivo［J］.Neuron，2000，28（2）：527-536.

［3］ Dzhala V I，Staley K J.Excitatory Actions of Endogenously Released GABA Contribute to Initiation of Ictal Epileptiform Activity in the Developing Hippocampus［J］.The Journal of Neuroscience，2003，23（5）：1840-1846.

［4］ Palop J J，Chin J，Roberson E D，et al.Aberrant Excitatory Neuronal Activity and Compensatory Remodeling of Inhibitory Hippocampal Circuits in Mouse Models of Alzheimer's Disease［J］.Neuron，2007，55（5）：697-711.

［5］ Palop J J，Mucke L.Synaptic Depression and Aberrant Excitatory Network Activity in Alzheimer's disease：Two Faces of the Same Coin？［J］.Neuromolecular Medicine，2010，12（1）：48-55.

［6］ Heinrich A，Andó R，Túri G，et al.K+Depolarization Evokes ATP，Adenosine and Glutamate Release from Glia in Rat Hippocampus：A Microelectrode Biosensor Study［J］.British Journal of Pharmacology，2012，167（5）：1003-1020.

［7］ GrossGW，RhoadesB，JordanR.NeuronalNetworksforBiochemical Sensing［J］.SensorsandActuatorsB：Chemical，1992，6（1）：1-8.

［8］ Liu Z，Ren G，Zhang T，et al.The Inhibitory Effects of Nano-Ag on Voltage-ated Potassium Currents of Hippocampal CA1 Neurons ［J］.Environmental Toxicology，2011，26（5）：552-558.

［9］ Oleskevich S，Descarries L.Quantified Distribution of the Serotonin Innervation in Adult Rat Hippocampus［J］.Neuroscience，1990，34（1）：19-33.

［10］Salgado D，Alkadhi K A.Inhibition of Epileptiform Activity by Serotonin in Rat CA1 Neurons［J］.Brain Research，1995，669（2）：176-182.

［11］Lu K-T，Gean P-W.Endogenous Serotonin Inhibits Epileptiform Activity in Rat Hippocampal CA1 Neurons Via 5-Hydroxytryptamine＜sub＞1A＜/sub＞Receptor Activation［J］.Neuroscience，1998，86（3）：729-737.

［12］S?rman E，Wang D，Hajos M，et al.Control of Hippocampal Theta Rhythm by Serotonin：Role of 5-HT2c Receptors［J］.Neuropharmacology，2011，61（3）：489-494.

［13］Celada P，Puig M V，Artigas F.Serotonin Modulation of Cortica lNeurons and Networks［J］.Frontiers in Integrative Neuroscience，2013，7（25）：1-20.

［14］曹端喜，莊柳靜，蘇凱麒，等.基于Wi-Fi技術的穿戴式動物嗅覺機器人［J］.傳感技術學報，2014，27（3）：303-309.

［15］Liu Q，Zhang F，Hu N，et al.Microelectrode Recording of Tissue Neural Oscillations for a Bionic Olfactory Biosensor［J］.Journal of Bionic Engineering，2012，9（4）：494-500.

［16］Chen Q，Xiao L，Liu Q，et al.An Olfactory Bulb Slice-Based BiosensorforMulti-SiteExtracellularRecordingofNeuralNetworks［J］.BiosensorsandBioelectronics，2011，26（7）：3313-3319.

［17］徐瑩，韓斌，徐銘恩，等.基于MONTE-CARLO模型的細胞傳感器納米顆粒表面處理分析［J］.傳感技術學報，2010，22（8）：480-486.

［18］Andersen P，Silfvenius H，Sundberg S，et al.Functional Characteristics of Unmyelinated Fibres in the Hippocampal Cortex［J］. Brain Research，1978，144（1）：11-18.

［19］Katz D B，Simon S，Nicolelis M A.Dynamic and Multimodal Responses of Gustatory Cortical Neurons in Awake Rats［J］.The Journal of Neuroscience，2001，21（12）：4478-4489.

［20］Ropert N.Inhibitory Action of Serotonin in CA1 Hippocampal Neurons＜i＞In vitro＜/i＞［J］.Neuroscience，1988，26（1）：69-81.

［21］Ropert N，Guy N.Serotonin Facilitates GABAergic Transmission in the CA1 Region of Rat Hippocampus in vitro［J］.The Journal of Physiology，1991，441（1）：121-136.

［22］張威，胡靚，肖麗丹，等.自組裝技術在細胞傳感器相容性設計中的應用［J］.浙江大學學報：工學版，2012，46（2）：345-350.

［23］Stawarski M，Rutkowska-Wlodarczyk I，Zeug A，et al.Genetically Encoded FRET-Based Biosensor for Imaging MMP-9 Activity［J］.Biomaterials，2014，35（5）：1402-1410.

［24］王天星，黎洪波，蘇凱麒，等.基于細胞電阻抗傳感器的細胞多生理參數分析系統設計［J］.傳感技術學報，2014，27（3）：1589-1595.［25］Soma N，Watanabe N，Shoji A，et al.Implantable Patch Sensor for L-Glutamate in Hippocampal Slices［J］.Analytical Sciences，2013，29（2）：181-185.

胡 靚（1988-），女，博士研究生，浙江大學生物醫學工程與儀器學院。主要研究方向為生物傳感器，味覺傳感器，huliang1226@zju.edu.cn；

王 平（1962-），男，博士，教授，浙江大學生物醫學工程與儀器科學學院、生物傳感器國家專業實驗室主任、生物醫學工程教育部重點實驗室主任國家杰出青年科學基金獲得者。主要研究方向傳感器與檢測技術，生物芯片于生物電子學，人工嗅覺與人工味覺，cnpwang@zju.edu.cn。

Hippocampal Neuronal Network Biosensor and Its Application in Recording Network Activity with 5-HT Stimulation*

HU Liang1，2，QI Zhen1，WANG Qing1，LI Rong1，WANG Ping1，2*
（1.Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology，Shanghai 200050，China）

Hippocampal neural activities have been proved to play important roles in various behaviors such as memoryand learning. 5-hydroxytryptamine（5-HT）isoneimportantneuraltransmitterinvolved in theseprocesses.Currently， some approaches revealed part of 5-HT effect on hippocampal activities；however，they did not illustrate the visual and direct electrophysiological activities in hippocampal neural networks. Thus，a microelectrode array （MEA） sensing platform were established in order to investigate the effect of 5-HT on simplified hippocampal neuronal networks （HNNs） in vitro. Taking advantage of our self-designed 60-channel MEA chip，multi-site electrophysiological signals of the HNNs can be recorded simultaneously in a non-invasive and convenient way. Experimental results confirmed that 100 μM 5- HT completely abolished the action potentials of hippocampal neurons but has little effect on the low frequency oscillation. This study suggests this HNN-based biosensor can monitor and record neuronal electrophysiology in a long term. Andthismulti-sitesensingplatform becomesapromisingapproachinthestudyofneuronalnetworkactivity.

biosensor；hippocampal neuronal network；microelectrode array（MEA）；neuronal network activity；5-hydroxytryptamine（5-HT）；network oscillation EEACC：7230

TP393

A

1004-1699（2015）07-0947-06

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.07.001

項目來源：國家自然科學基金項目（30970765）；教育部博士點基金項目（20120101130011）

2014-10-27 修改日期：2015-04-09