淺談蛋白質印跡法操作過程中的實驗技巧

宋亮　陳丹丹

摘 要：蛋白質印跡法（蛋白免疫印跡）即Western Blot，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。其基本原理是將電泳分離后的細胞或組織蛋白從凝膠轉移到固相支持物上，然后用特異性抗體對相應抗原進行著色，隨后通過分析著色的位置和著色深度來反映蛋白質表達情況。該文通過介紹實驗操作過程中的一些心得體會，簡要闡述如何提高蛋白質印跡法的實驗效果。

關鍵詞：蛋白印跡法 實驗技巧 生物學

中圖分類號：Q81 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）07（c）-0063-02

蛋白質印跡法是分子生物學和生物化學中常用于分離和識別特異性蛋白的一種實驗方法。這項技術主要包括三個主要步驟：（1）基于分子重量，利用電泳進行蛋白分離。（2）將蛋白從凝膠轉移至固相支持物。（3）利用特異性的一抗和二抗使目的蛋白顯色。隨后通過分析著色的位置和著色深度來反映蛋白質表達情況。Western Blot實驗簡單而又復雜，簡單在于原理和操作過程，復雜在于每一步的精細化操作，常常一個很小環節的疏忽就會對最終結果產生很大的影響。該文中，作者結合自身多年的實驗經歷，簡要談談如何提高蛋白質印跡法的效果。

1 制膠

市售的成品膠簡單，省時，效果佳，但價格相對昂貴，因此多數實驗室仍選擇使用聚丙烯酰胺自行配膠。由于凝膠的質量會直接影響后續的實驗，因此要特別注意以下幾點。（1） 液態的分離膠及濃縮膠均可事先配好，四甲基乙二胺（TEMED）及10% 過硫酸銨（APS）除外，過濾后作為儲存液避光存放于4℃，臨用前取出室溫平衡，否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡。（2）APS的使用比例大約0.7～0.8：100，通常情況下分離膠濃度越高，使用的APS濃度應越低。（3） APS一定要新鮮，最好現配現用，如在4℃存放，勿超過兩周。也可將配好的APS分裝后凍存在-20℃，隨時取用。（4）混合好的凝膠要均一沒有氣泡，否則影響聚合，導致電泳帶畸形。（5） 灌好膠后需等待其完全凝固才可上樣，具體凝固時間與加入的APS及TEMED配比有關，通常在0.5～1 h內凝集最好。過快表示APS和/或TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，而且電泳時容易燒膠。過慢則表明兩種試劑用量不夠。需要注意的是，膠結構的完全形成需要較長時間，肉眼觀察到膠凝時，其內部分子的排列實際尚未完成。因此也可提前一天制膠，保濕放置在4℃過夜，次日使用。

2 上樣電泳

制膠完成后，可使用提前變性好的蛋白樣品上樣電泳。上樣前蛋白樣品最好瞬時離心，隨后輕微混勻。加樣時間要盡量短，以免樣品擴散。為避免邊緣效應，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。另外，上樣量不宜過多，以免蛋白條帶過于臃腫，影響美觀。隨后，只需要控制好電流強度，根據預染的蛋白Marker判斷目的蛋白的位置，適時終止電泳即可。有觀點認為分離膠的下1/3處是最佳分辨區，個人經驗是1/2處至下1/3處區別不大，考慮到蛋白的區分主要依靠分離膠的濃度，所以在此區間可隨時停止電泳，只需注意不要讓目的蛋白過于靠近凝膠的下緣或是移動出凝膠就行。電泳過程中有時會出現一些異常現象，如：（1）條帶呈笑臉狀（︶），這是由于凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。（2）條帶呈皺眉狀（︵），可能是裝置不合適，或是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或兩邊聚合不完全。（3）條帶出現拖尾，提示蛋白樣品溶解不好。（4）條帶出現紋理（縱向條紋）：可能是樣品中含有不溶性顆粒。（5）條帶偏斜，是由于電極不平衡，或加樣位置偏斜。（6）條帶向兩邊擴散：提示加樣量過多。

3 轉膜

經過電泳分離后的蛋白質樣品需要經過“轉膜”步驟，即從凝膠轉移到膜上固定，才能用后續方法進行蛋白的檢測和顯色。為了防止已經分離的蛋白條帶在沒有電場的情況下擴散，轉膜需要盡快進行。不論使用濕轉還是半干轉，轉膜過程中特別需要注意的是兩個問題：（1）正確放置“三明治”的疊放次序，即：陽極、下層濾紙、膜、膠、上層濾紙、陰極。（2）仔細排除每層之間的氣泡，尤其是膜與膠之間的氣泡。大的氣泡可能會造成系統短路，小的氣泡則會影響蛋白質成功轉移至膜上。至于轉膜的時間和電流大小，需要根據目的蛋白的分子量進行調整。為防止轉膜過程中過多的熱量產生，可以提前將轉膜液放置在4℃預冷，并且在轉膜過程中使用冰盒降溫，從而改善轉膜效果。轉膜結束后可使用麗春紅S對膜直接染色來顯示蛋白條帶，從而檢測轉膜效果，它的好處是充分脫色后不會干擾后續的抗體孵育。

4 封閉、抗體孵育及發光鑒定

為了減少抗體孵育后的非特異條帶以及雜亂的背景，轉膜結束后需利用封閉液進行處理，以封閉膜上剩余的疏水結合位點。最常用的封閉液是脫脂奶粉，這是因為脫脂奶粉內的非特異性成分豐富，封閉效率高。需要注意的是，由于抗磷酸氨基酸抗體可以與牛奶中的某些成分結合，所以在檢測這些抗體時，不能使用脫脂奶粉作為封閉液，而需換用牛血清白蛋白 （BSA） 進行處理。封閉結束后就是決定蛋白質印跡法成敗的關鍵――使用針對于目的蛋白的一抗進行雜交。對于國內的大多數實驗室來講，選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，進口抗體，如Abcam，Cellsignaling和Sigma的一抗雖然效果好，但是價格昂貴。相比之下，Santa Cruz的抗體則量大，價位也便宜些，性價比較高。至于進口抗體國內分裝，或純國產抗體，質量則良莠不齊，購買時需要些勇氣及運氣。因此選擇一抗前最好根據發表的文獻來查找有效的抗體，慎重選擇。至于抗體（包括一抗及二抗）濃度一般要參照抗體說明書多次嘗試，選擇最適比例，合適的比例直接影響實驗結果以及背景。此外，加一抗、二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗、二抗洗凈，有利于降低背景。抗體孵育結束后，一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法進行發光鑒定。無論什么方法，都需要根據結果調整曝光或者顯色時間，達到最佳效果。

5 結語

雖然在蛋白印跡的操作過程中使用相應技巧可以改善實驗效果，但一抗的質量，以及待檢測蛋白的提取質量才是實驗成功的決定性環節，應受到充分重視。

參考文獻

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