多位點序列分型應用于致病性黃疸出血群鉤端螺旋體分析

張翠彩，徐建民，李秀文，曹志強，蔣秀高

2.江西省疾病預防控制中心，南昌 330029

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體引起的一種人獸共患病。鉤端螺旋體的傳統分類方法依賴于血清學分類，其采用暗視野顯微凝集試驗（The microscopic agglutination test，MAT）確定血清群，進一步采用凝集交叉吸收試驗（Cross Agglutinin Absorption Test，CAAT）確定血清型。鉤端螺旋體的血清型別極其復雜，目前世界上流行的主要致病性鉤端螺旋體可多達300多個血清型，隸屬于至少25個血清群。開展傳統的血清學分類方法，需要提前準備一系列的標準菌株或者標準血清，該試驗方法操作繁瑣，費時費力，只有在有條件的參考實驗室方可開展，因此，對于鉤端螺旋體的分型分析在基層實驗室受到很大的限制。隨著分子生物學技術的快速發展，多位點序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）逐漸被應用于病原體分子流行病學研究，該方法簡便快捷，不需要培養大量活菌，只需少量的DNA即可，結果數字化可進行不同實驗室間的對比分析。目前，MLST可較好的應用于鉤端螺旋體基因分型、流行病學溯源、種群結構、親緣進化關系分析等研究［1］。近年來，黃疸出血群是中國鉤端螺旋體病的主要致病性血清群［2］。本研究選取近年來我國四川、江西、湖南三個省份39株致病性黃疸出血群鉤端螺旋體菌株，采用MLST方法進行基因分型分析，初步探討我國致病性鉤端螺旋體的分子流行病學、種群結構、親緣進化關系等特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本研究共選用黃疸出血群致病性鉤端螺旋體菌株39株，分別來自于四川、江西、湖南3個省市的2006～2008年菌株。

1.2 主要試劑PCR Premix購自寶生物工程（大連）有限公司；100bp DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；基因組提取采用硅膠膜型TM基因組DNA提純試劑盒，購自北京賽百盛基因技術有限公司。

1.3 菌體DNA制備 采用EMJH液態培養基28℃培養7～10d，在對數生長期對菌體提取DNA，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.4 MLST位點的選擇及PCR擴增 參考2013年Boonsilp等報道的國際通用MLST研究方案［1］，選用7個管家基因位點pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進行PCR擴增，各位點信息見表1，引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。采用20μL反應體系進行擴增檢，Premix Ex Taq10.0μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，純水補充至20μL反應體積。PCR擴增程序如下：95℃ 預變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，擴增30個循環，最后72℃延伸10min。

表1 MLST分析中7個位點引物信息Tab.1 Primers of seven loci in MLST analysis

1.5 PCR產物檢測、測序、序列拼接 擴增產物陽性者直接純化、測序，采用雙向測通方法，由寶生物工程（大連）有限公司完成。利用contig軟件進行序列檢查、拼接，采用DNAStar軟件中的MegAlign模塊進行序列截取。

1.6 數據分析 將7個管家基因位點序列與MLST網站http：//www.mlst.net/上相應等位基因進行比較，獲得每株菌的等位基因譜（gluM－pntA－sucA－tpiA－pfkB－mreA－caiB），確 定 序 列 的ST型別。應用eBURST軟件分析各ST型別間的種群結構及親緣進化關系。利用BioNumerics軟件進行聚類分析，觀察菌株間的基因多態性情況。

2 結 果

2.1 MLST中7個位點等位基因情況 經序列比對分析發現，39株黃疸出血群菌株中，7個位點的多態性尚可，等位基因數目介于2～4之間，mreA位點多態性最高，呈現出4個等位基因，glmU位點的多態性最低，為2個等位基因，見表2。

2.2 基因多態性分析 MLST基因分型分析發現，39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株呈現5個ST型別，其中ST1為主要的優勢ST型別，占53.85%（21/39），其次依次為 ST143占 17.95%（7/39）、ST128占12.82%（5/39）、ST17占12.82%（5/39）、ST209占2.56%（1/39）。地區間ST 分布不盡相同，四川、江西地區以ST1為優勢型別，湖南地區以ST128為主要優勢型別，詳見表3。

表2 MLST中每個位點的等位基因情況Tab.2 Number of unique alleles at each locus in MLST analysis

表3 39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株ST型別情況Tab.3 Number of sequence types（STs）for 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.3 eBURST軟件分析 結果顯示：39株菌株分為2個Clonal complexes和1個singleton，見圖1。其中Group1占66.67%（26/39），包含ST1、ST128兩個ST型別，來自于四川、江西、湖南三個地區；Group2占20.51%（8/39），包含 ST143、ST209兩個ST型別，全部來自于2006～2007年江西菌株；一個單獨的 singleton，占 12.82%（5/39），僅由ST17組成，全部來自于2007～2008年江西菌株，該singleton與其他兩個Group親緣進化關系較遠，為一個獨立的克隆群。

圖1 39株黃疸出血群鉤端螺旋體eBURST分析Fig.1 eBURST analysis of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.4 BioNumerics軟件分析 采用UPGMA聚類分析發現：39株菌株共分為3個Group群5種基因型，見圖2。UPGMA聚類圖中的分群結構與eBURST分析結果一致。Group1包括ST128和ST1共2種基因型；Group2包括ST143和ST209共2種基因型，全部為2006～2007年江西菌株；Group3包括ST17僅1種基因型，全部為2007～2008年江西菌株。由聚類圖顯示：ST1同時分布于四川、江西、湖南三個地區，為本研究中南方地區的優勢ST型別；ST143、ST209和ST17三個ST型別僅分布在江西地區；而ST128僅分布于湖南地區，因此在一定程度上MLST基因型別存在明顯的地域性差異。

圖2 39株黃疸出血群鉤端螺旋體UPGMA聚類分析Fig.2 UPGMA dendrogram of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

3 討 論

多位點序列分析（MLST），主要應用于菌株種群結構、親緣進化關系、流行病學溯源等研究領域。黃疸出血群是中國鉤端螺旋體病的主要致病性血清群，占歷年來所發病例的60%以上［2］。本研究采用MLST技術對我國四川、江西、湖南三個地區2006～2008年的39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株進行基因分型，結果發現7個位點多態性較好，39株分離株呈現3個克隆群5種ST型。

有MLVA研究報道，細菌基因型與地理分布有一定的相關性［3］。在本次MLST研究中，我們同樣發現MLST基因型呈現一定的地域性特征，而同一地區內部菌株的ST型別相似性度較高。由聚類圖顯示：ST1為本研究中南方三個省份的優勢ST型別，占53.85%（21/39），與李世軍等［4］2012年報道分離自貴州的3株黃疸出血群菌株均為ST1型別相一致，推測可能ST1型別在外界氣候、自然環境以及宿主環境變遷中具有較好的生存優勢，因而普遍分布于南方多個省份。從不同地區ST型別多態性來看，存在明顯的地域性差異。四川、湖南的ST型別相對單一，四川地區僅呈現ST1一種型別，湖南地區僅呈現ST128和ST1兩種ST型別，eBURST種群結構分析發現：ST128和ST1均隸屬于Group1克隆群，親緣進化關系較近，而江西地區的ST型別多態性較高，呈現出ST1、ST17、ST143、ST209共四個型別，48.15%（13/27）的江西菌株隸屬于Group2和一個單獨的singleton，與Group1的親緣進化關系較遠。地區間ST型別的差異可能是由于菌株的自身遺傳變異與當地區域性的氣候、環境變遷存在一定的相關性，具體的原因還有待進一步的深入研究驗證。Voronina等［5］2014年對來自于俄國的11株黃疸出血群菌株進行MLST研究，共發現ST17、ST199、ST23和ST206四種ST型別。Romero等［6］2011年對1986～2009年間法國圣保羅地區的90株黃疸出血群菌株研究發現，只呈現ST17一種ST型別。Caimi等［7］2012年對1993～2005年間阿根廷的3株黃疸出血群菌株進行基因分型研究，僅發現ST17一種ST型別。綜合國內、國際ST型別研究結果發現，中國黃疸出血群菌株基因多態性較高，除ST17作為優勢型別在中國及世界其他多個國家廣泛分布外，某些國家仍存在一些獨特的ST型別，呈現一定程度的地理分布特征。

Thaipadungpanit等［8］對泰國東北部2000～2005年的鉤體疫情進行MLST研究，結果發現ST34為主要的優勢克隆群，隸屬為秋季群菌株，提示MLST分型方法可作為流行病學溯源的有力工具。本研究的菌株主要來自于中國鉤端螺旋體病國家級哨點監測現場，涉及的菌株為流行病學非關聯的監測菌株，本研究中之所以每個地區內部的ST型別高度相似，可能是由于當年的分離菌株均來自于同一時間同一個監測現場，宿主棲息生存的自然環境極其相似，因而在分子遺傳水平上高度相似，該MLST方法是否可進一步應用于鉤體病的流行病學溯源，尚需要適當數量的疫情暴發關聯菌株來進一步驗證。

通過本次基因分型研究發現，目前國際通用的MLST方案可初步應用于中國致病性鉤端螺旋體的基因多態性、種群結構分析。雖然MLST在中國的應用還處于初級階段，尚需要擴大適當數目的菌株量來驗證其實用性，但是與傳統的血清學分類方法相比，該方法操作簡單、成本低廉，不用培養大量的鉤體菌，實驗結果可在不同實驗室間比對，將逐漸成為鉤端螺旋體實驗室網絡監測、分子流行病學研究的有利工具。

［1］Boonsilp S，Thaipadungpanit J，Amornchai P，et al.A single multilocus sequence typing（MLST）scheme for seven pathogenic Leptospira species［J］.PLoS Negl Trop Dis，2013，7（1）：e1954.DOI：10.1371/journal.pntd.0001954

［2］Zhang C，Wang H，Yan J.Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades［J］.Microbes Infect，2012，14（4）：317－323.DOI：10.1016/j.micinf.2011.11.007

［3］Zhang CC，Nie YX，Li XW，et al.Application of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis（MLVA）for molecular typing ofLeptospira interrogansserogroup Icterohaemorrhag［J］.Chin J Microbiol Immunol，2009，29（12）：1144－1147.DOI：10.3760/cma.j.issn.0254－5101.2009.12.025（in Chinese）張翠彩，聶一新，李秀文，等.黃疸出血群鉤端螺旋體MLVA分型研究.中華微生物學和免疫學雜志，2009，29（12）：1144－1147.

［4］Li SJ，Zhang CC，Li XW，et al.Molecular typing ofLeptospira interrogansstrains isolated fromRattus tanezumiin Guizhou Province，Southwest of China［J］.Biomed Environ Sci，2012，25（5）：542－548.DOI：10.3967/0895－3988.2012.05.007

［5］Voronina OL，Kunda MS，Aksenova EI，et al.The characteristics of ubiquitous and uniqueLeptospirastrains from the collection of Russian centre for leptospirosis［J］.Biomed Res Int，2014，2014：649034.DOI：10.1155/2014/649034

［6］Romero EC，Blanco RM，Galloway RL.Analysis of multilocus sequence typing for identification ofLeptospiraisolates in Brazil［J］.J Clin Microbiol，2011，49（11）：3940－3942.DOI：10.1128/JCM.01119－11

［7］Caimi K，Varni V，Melendez Y，et al.A combined approach of VNTR and MLST analysis：improving molecular typing of Argentinean isolates ofLeptospira interrogans［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2012，107（5）：644－651.

［8］Thaipadungpanit J，Wuthiekanun V，Chierakul W，et al.A dominant clone ofLeptospira interrogansassociated with an outbreak of human leptospirosis in Thailand［J］.PLoS Negl Trop Dis，2007，1（1）：e56.