貴州省一例人感染豬鏈球菌病例的病原學檢測與分析

馬 青，李世軍，劉 英，田克誠，唐光鵬，王定明

人感染豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcussuis）感染人而引起的人獸共患病[1]，豬鏈球菌（S.suis）目前已知有35個血清型，其中豬鏈球菌2型（S.suisserotype 2）在世界上流行最廣，致病性最強，同時能引起人的感染，是一種重要的人獸共患病病原[2]。近年來國內已發生多起人感染豬鏈球菌病疫情，1998年我國江蘇省豬鏈球菌病暴發，造成數萬頭生豬死亡，并導致幾十例人感染豬鏈球菌病，死亡14例[3]；2005年四川省報告人感染豬鏈球菌病204例，死亡38例，為國內外迄今為止見于報道的最大規模人感染豬鏈球菌病疫情[4]；人感染豬鏈球菌病散發病例在其它省份也時有發生[1，5－7]。貴州省2006年于羅甸縣一例病例中分離出豬鏈球菌2型菌株[8]。本研究對2013年貴州省1起人感染豬鏈球菌疑似疫情進行病原學調查與分析，了解病原學特征，為疫情的確定及患者的診斷和治療提供病原學依據。

1 材料和方法

1.1 病例信息 患者邰某某，男，42歲，來自劍河縣觀么鄉觀么村，該村位于劍河縣觀么鄉政府所在地，距離劍河縣人民政府所在地65km。觀么村有4個村民小組，186戶，928人，均為苗族。家畜為圈養，無放養習慣。患者曾于2013年2月4日宰殺自家年豬，當日又到本村村民費某某家宰殺生豬1頭，2月5日又到該村另一村民錢某某家宰殺生豬，在分割肉時不小心劃傷左手指，于2013年2月15日發病，臨床癥狀主要有寒戰、發熱和嗜睡狀，病程進展迅速，腦膜炎癥狀明顯，經貴陽醫學院第二附屬醫院臨床診斷為人感染豬鏈球菌病疑似病例。

1.2 標本 經貴陽醫學院第二附屬醫院臨床診斷的1例劍河縣人感染豬鏈球菌病疑似病例的血液來源菌株。

1.3 實驗試劑 豬鏈球菌2型單克隆抗體由中國疾病預防控制中心提供，API 20Strep生化鑒定條購自法國生物梅里埃公司，PCR試劑為Takara公司生產商品試劑盒。

1.4 菌落觀查與染色鏡檢 將可疑菌株接種于血瓊脂平板置37。C二氧化碳培養箱培養24h，觀察菌落特征，挑取單個可疑菌落進行革蘭染色后鏡檢。

1.5 血清分型試驗 挑取菌落做玻片凝集試驗，同時設生理鹽水對照。

1.6 生化鑒定 挑取單個菌落轉種羊血瓊脂平板，于37。C二氧化碳培養箱培養24h。按照API 20 Strep試劑盒說明書操作根據生化反應結果進行編碼，對照API 20Strep生化系統編碼判定結果[9]。

1.7 豬鏈球菌靶基因檢測 按照中國疾病預防控制中心提供的引物，見表1和PCR方法檢測豬鏈球菌種特異的16SrRNA基因、豬鏈球菌2型cps2J、mrp、sly和ef。反應體系（50μL）為上下游引物各2 μL、模板2μL、Taqmix 25μL、去離子水19μL。mrp、cps2J和16SrRNA基因的擴增參數為94。C預變性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30個循環，最后72。C延伸5min。Sly基因擴增參數為94。C預變性5min；94。C60s，51。C60s，72。C90s，30個循環，最后72。C延伸5min。Ef基因擴增參數為94。C預變性5min；94。C30s，56。C30s，72。C30s，30個循環，最后72。C延伸5min。

表1 豬鏈球菌基因檢測引物Tab.1 Primers of Streptococcus suis

2 結 果

2.1 菌落特征與鏡檢結果 可疑菌株在羊血瓊脂平板上于37。C二氧化碳培養箱培養24h后出現直經約1mm、表面突起、光滑濕潤、圓整、半透明略帶灰白色、呈α溶血的菌落，革蘭染色后油鏡下呈成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌。

2.2 血清分型結果 可疑菌株菌落與豬鏈球菌2型單克隆抗體發生凝集反應，生理鹽水對照未發生凝集反應。

2.3 生化鑒定結果 血液中分離菌株的API 20 Strep生化試驗結果編碼為4640453，對照編碼表結果判定為豬鏈球菌II型，API 20Strep生化結果詳見表2。

2.4 PCR檢測結果 PCR檢測結果顯示豬鏈球菌種特異的16SrRNA基因、豬鏈球菌2型特有的毒力基因cps2J及毒力基因mrp、sly和ef均出現預期大小的DNA擴增條帶，見圖1。

3 討 論

豬鏈球菌是一種人獸共患病原菌，呈世界性分布。豬鏈球菌共有35個血清型，盡管所有血清型都能致病，但是能感染人的致病血清型主要包括1／2、1、2、7、9和14型6種類型。其中血清2型廣泛存在于豬的呼吸道中，是從病豬和患者中分離最多的一種致病菌，也是我國的主要致病菌，引起1998年江蘇和2005年四川人感染豬鏈球菌病疫情大暴發的病原也是血清2型菌株[4－5]。豬鏈球菌2型具有很強的侵襲能力，并產生致病性很強的外毒素，引起感染者發生嚴重的不可逆的休克及DIC，最后發生多器官功能衰竭而死亡[2]。

表2 疑似豬鏈球菌菌株生化鑒定結果Tab.2 Biochemical identification results of suspected Streptococcus suis

圖1 疑似豬鏈球菌菌株PCR檢測結果Fig.1 Electrophoretic bands of suspected Streptococcus suis

API 20Strep生化條與常規生化試驗相比，操作方便且可直接鑒定到型，馮澤惠[9]等應用此方法對24株鏈球菌進行了種的鑒定，鑒定符合率達91.67%。因此API 20Strep生化條可作為豬鏈球菌的一種簡便可靠的方法。本研究應用API 20 Strep生化系統對疑似菌株進行鑒定，結果為豬鏈球菌2型，并與血清凝集試驗結果相符。

豬鏈球菌16SrRNA基因片段具有種特異性，cps2J基因為豬鏈球菌2型的特異性基因，可以作為鑒定豬鏈球菌2型的靶基因，因此本研究選擇16SrRNA和cps2J基因對疑似菌株進行鑒定，其結果均為陽性，提示本研究中的疑似菌株為豬鏈球菌2型菌株。據資料報道[10]，并不是所有豬鏈球菌2型都對人致病，豬鏈球菌2型存在著強致病力、弱致病力以及無致病力菌株。豬鏈球菌2型致病力取決于它的毒力因子，其中較為重要的主要包括莢膜多糖（cps）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、細胞外因子（ef）、溶血素（sly）以及多種具有毒性作用的蛋白。曾巧英等[11]研究證明mrp可單獨作為豬鏈球菌2型的毒力因子。由于mrp和ef在強毒株中檢出率很高，在非致病菌株中檢出率很低，因而mrp和ef常被認為是豬鏈球菌2型高致病性的標志[12]。為了證實本研究中的菌株為有致病力的菌株，本研究以cps2J、mrp、sly和ef為靶基因對疑似菌株進行了PCR鑒定，其結果均為陽性，表明本次分離菌株為豬鏈球菌2型強毒株。

流行病學調查資料顯示，本研究中患者曾于2013年2月4日宰殺自家年豬，當日又到本村村民費某某家宰殺生豬1頭，2月5日又到該村另一村民錢某某家宰殺生豬，在分割肉時不小心劃傷左手指，于2月15日晚出現頭痛、嘔吐、畏寒發熱等癥狀。結合本研究病原學調查結果，可以判定該起疫情為一起人感染豬鏈球菌病疫情，患者感染途徑為接觸被豬鏈球菌污染的生豬肉通過傷口而感染。

值得關注的是，患者家及幫忙宰殺豬的兩戶村民家中喂養的生豬中均無病死現象，患者此次宰殺生豬之前也未曾接觸過病死豬，也未到過外地。說明表觀健康豬群有攜帶致病性豬鏈球菌2型的可能性，應在加強表觀健康豬群的豬鏈球菌監測的同時，對從事生豬屠宰、加工、銷售等從業人員或其他相關人員采取嚴格的個人防護措施以防止豬鏈球菌感染。

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