桂枝芍藥知母湯對CIA大鼠關節炎的作用及其機制研究

胡雨峰 俞晶華 奚飛飛

（南京中醫藥大學，江蘇南京 210023）

桂枝芍藥知母湯對CIA大鼠關節炎的作用及其機制研究

胡雨峰 俞晶華 奚飛飛

（南京中醫藥大學，江蘇南京 210023）

目的：研究桂枝芍藥知母湯對CIA模型大鼠關節炎癥反應的治療作用及其機制。方法：建立Ⅱ型膠原誘導（CIA）動物模型，隨機分為模型組、雷公藤多苷片組和桂枝芍藥知母湯高、中、低劑量組，另取10只正常大鼠作為空白對照組，分別給藥后觀察各組大鼠關節評分和腫脹度、病理改變評分，并比較各組大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表達。結果：模型組大鼠關節評分、左右足體積、造模足關節腫脹度、踝關節病理改變評分均明顯高于空白對照組；治療16d后，桂枝芍藥知母湯各劑量組大鼠上述指標均明顯低于模型組（P＜0.01）。模型組大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表達均明顯高于空白對照組（P＜0.01），治療后桂枝芍藥知母湯中、高劑量組大鼠上述指標明顯低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。結論：桂枝芍藥知母湯可通過調節炎性細胞因子的表達而明顯緩解CIA模型動物的各種炎癥反應。

桂枝芍藥知母湯 類風濕關節炎 關節評分 病理學 SD大鼠 實驗研究

桂枝芍藥知母湯（下簡稱桂芍知母湯）出自漢·張仲景《金匱要略·中風歷節病脈證并治篇》，具有祛風除濕、溫經散寒、滋陰清熱之功效，主要用于治療風寒濕痹日久，漸次化熱傷陰之證，至今仍為臨床上的常用方、基礎方，尤多被用于治療類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）等以關節病變為主的病癥。本研究在建立Ⅱ型膠原誘導（CollagenⅡ-induced arthritis，CIA）動物模型的基礎上，觀察桂芍知母湯對模型動物關節炎癥的治療作用及其對血清白介素（Interleukin，IL）-1、IL-6及IL-17表達的影響，為其治療RA的作用及機制進行闡釋和解讀。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SD大鼠60只，雌雄各半，體重（200g±20）g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，生產許可證：SCXK（滬）2007-0005，實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2007-0030。

1.2 實驗藥物桂芍知母湯，藥物組成：桂枝12g，白芍9g，甘草6g，麻黃12g，生姜15g，白術15g，知母12g，防風12g，炮附子10g。藥物均購自南京中醫藥大學百草堂中醫門診部，由南京中醫藥大學藥學院制劑室制備成濃度分別為1.2、0.6及0.3g/mL的水煎劑。雷公藤多苷片，10mg/片，由浙江得恩德制藥有限公司生產，批號：1108101，研缽研碎后加蒸餾水制成濃度為0.001g/mL的混懸液。

1.3 實驗試劑牛Ⅱ型膠原，美國Sigma，批號：A7906；完全弗氏佐劑（Complete Frund＇s Adjuvant，CFA），美國Sigma，批號：F5881；IL-1、IL-6及IL-17 ELISA試劑盒，上海韻涵生物科技公司，批號20111201B；焦碳酸二乙酯（DEPC），美國Sigma。

1.4 實驗儀器和設備YLS-7B型大鼠趾體積測量儀，山東省醫學科學院設備站；SZ61TRC-ILST型解剖鏡，日本Olympus；ROTOFIX 32A型離心機，德國Hettich；-80℃低溫冰箱，日本Sanyo；Multiskan MK3型全自動酶標儀，芬蘭Labsystems。

2 實驗方法

2.1 建立CIA模型將牛Ⅱ型天然膠原溶解于0.1mol/L醋酸溶液中，制成4mg/mL的溶液，并置于4℃冰箱過夜。實驗當日將含弗氏完全佐劑與CⅡ膠原等體積于冰上充分震蕩乳化制成CⅡ乳劑。用微量注射器于大鼠左后足跖皮內、頸、背、腹、尾根等5個部位分別注射CⅡ乳劑0.1mL，總量0.5mL，并于14d后用同等劑量免疫原在相同部位加強免疫一次。通過定期測定各組大鼠的關節炎指數（ArthriticIndex，AI）及檢測大鼠雙后足的腫脹度判斷模型建立是否成功。

2.2 分組與給藥取造模成功的大鼠50只，隨機分為5組，每組10只。另取10只正常大鼠作為空白對照組。給藥方案：空白對照組與模型組，給予等容量蒸餾水；桂芍知母湯高、中、低劑量組，分別給予桂芍知母湯水煎劑18g生藥/（kg·d）（濃度1.2g/mL）、9g生藥/（kg·d）（濃度0.6g/mL）以及4.5g生藥/（kg·d）（濃度0.3g/mL）；雷公藤多苷片組，給予雷公藤多苷片混懸液0.015g/（kg·d）。以上各組均予灌胃給藥，給藥體積均為15mL/（kg·d）。第二次加強免疫后即日開始給藥，連續給藥16d。

2.3 關節評分、雙足體積測量及腫脹度計算關節評分采用0—4級關節評分法［1］。0分：腳爪正常或無炎癥；1分：趾關節腫脹或輕度發紅；2分：趾關節和足跖發紅并且腫脹；3分：踝關節以下的整個腳爪全部發紅并且腫脹；4分：踝關節嚴重發紅且腫脹，關節有變形跡象。以第二次加強免疫當天為d0，此后每隔4d用大鼠趾體積測量儀測量大鼠左右足跖體積，檢測并記錄關節炎指數積分，以2個腳爪的評分之和作為每個大鼠的關節評分，并按公示計算出其關節腫脹度。

腫脹度ER（%）=（Vt-V0）/ V0×100%（V0為造模前體積，Vt為檢測時體積）

2.4 樣本提取及處理連續給藥16d后使用脫頸法處死大鼠。將大鼠仰臥位固定，70%酒精消毒，大腿外旋，從內側切開并剝離皮膚，沿膝關節正中線縱向切開直至暴露出以膝關節為中心的約3cm×3cm大小的區域，用齒鑷提起髕骨。沿髕骨上沿約0.3cm×0.4cm處向下切割直至股骨，再沿髕骨向下分離至脛骨，此時即可打開膝關節腔，由髕骨下極向上延續的一層平滑光亮且呈淡黃色的軟組織即為滑膜。在解剖鏡下以眼科剪小心分離滑膜，將部分組織分組加入適量生理鹽水搗碎，3000r/min離心10min后取上清液凍于-80℃低溫冰箱保存備用。

2.5 病理組織學檢查及評分處死大鼠后，將大鼠的踝關節用10%福爾馬林固定，經過脫鈣、脫水、常規石蠟包埋、切片（厚度約4～5μm）和常規HE染色后，由病理專業人員檢查閱片。具體觀察指征包括關節炎癥表現、關節滑膜病變、關節骨質破壞等，主要檢查指標包含了炎細胞浸潤、血管充血、滑膜腫脹、組織壞死等病理變化，最終根據病變輕重程度進行評分，按正常和輕、中、重度異常分別計0～3分。

2.6 滑膜上清液IL-1、IL-6及IL-17含量檢測采用酶聯免疫吸附法（ELISA），按照試劑盒使用說明測定組織勻漿上清液中IL-1、IL-6及IL-17之含量。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠治療各時期關節炎評分比較見表1。

3.2 各組大鼠治療各時期左右足關節體積比較見表2。

3.3 各組大鼠左足（造模足）治療各時期關節腫脹度比較見表3。

表1 各組大鼠治療各時期關節評分（±s）分

表1 各組大鼠治療各時期關節評分（±s）分

注：與同期空白對照組比較，▲▲P＜0.01；與同期模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 各組大鼠治療各時期左、右足體積比較（±s）mL

表2 各組大鼠治療各時期左、右足體積比較（±s）mL

注：與同期空白對照組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.01；與同期模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 各組大鼠治療后踝關節病理評分比較見表4

3.5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6及IL-17表達比較見表5。

4 討論

RA是一種以關節和關節周圍組織的非感染性炎癥為主的異質性、系統性、慢性自身免疫性疾病。現代中醫學者一般將RA歸屬于“痹證”范疇，但因其病情頑固，遷延難愈，且疼痛遍歷周身多個關節的特點，又有別于一般的痹證，是痹證中的特殊類型，尤其與《金匱要略·中風歷節病脈證并治篇》中提及的“歷節”相似，所謂：“病歷節，不可屈伸”，“諸肢節疼痛，身體尫羸，腳腫如脫”。而桂芍知母湯正是醫圣張仲景為風濕歷節所設，全方僅用藥物九味，卻配伍精妙，藥少效宏，具有寒溫并用、溫散而不傷陰、養陰而不礙陽等特點，是當代醫家用以治療RA的常用方、基礎方。

RA的主要表現包括雙手、腕和足關節的對稱性多關節炎，亦可累及膝、髖等關節，并可伴發諸多關節外表現。在其關節表現中，腫脹和變形是較為典型的癥狀。本研究所采用的CIA模型所引發的炎癥反應為多發性外周關節炎（以雙足，踝、膝關節為主），關節局部可紅腫和畸形，病理變化為增生性滑膜炎，關節軟骨破壞以及骨侵蝕，血管翳形成和炎性細胞浸潤，其臨床表現、實驗室指標與免疫及病理學改變方面均接近人類RA，故在CIA大鼠模型的基礎上通過藥物干預并定期觀察大鼠關節評分變化，雙足體積、腫脹度趨勢及膝關節病理改變可了解藥物對于關節炎癥的治療作用。

炎性細胞因子的異常表達在RA的炎癥反應中起到了重要的作用，被認為是RA炎癥及關節損傷的重要介質［2］。這其中，IL-1、IL-6及IL-17的表達與RA的發病均有密切關聯。Arend［3］發現，無論是在動物模型還是患者體內，IL-1受體都是重要的抗炎因子，在動物模型中發現，IL-1受體缺乏使得癥狀得以加重。有實驗證明，滑膜液中的IL-6含量可反映局部前炎癥變化，尤其是破壞性的病變［4］。Veldhoen等［5］報道，IL-6和轉化生長因子-β（TGF-β）發揮協同作用時，可誘導Th17細胞合成并分泌IL-17，而IL-17又能刺激滑膜成纖維細胞分泌IL-6，造成炎癥的進展。而Chabaud等［6］發現，IL-17能通過滑膜細胞使得基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）的表達水平升高5倍，而在抗IL-17抗體作用下，MMP-1的表達水平降低50%，顯示了IL-17在RA損傷中的作用。IL-17致炎的主要途徑為促進T細胞激活并刺激上皮細胞、成纖維細胞產生大量炎性細胞因子如IL-6、動脈粥樣硬化和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等而引起炎癥［7］。

表3 各組大鼠治療各時期左足（造模足）關節腫脹度比較（±s）

表3 各組大鼠治療各時期左足（造模足）關節腫脹度比較（±s）

注：與同期模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

d16組別關節腫脹度（%）動物數（只）d0d4d8d12給藥劑量（g·kg-1·d-1）10-桂芍知母湯高劑量組44.2±19.9*41.7±20.7**35.9±16.5**21.7±12.5**48.9±21.4模型組69.2±32.870.1±32.579.4±32.689.6±29.795.8±34.9 1018桂芍知母湯中劑量組10953.2±19.243.2±17.0*35.9±14.5**28.1±11.4**20.7±08.5**桂芍知母湯低劑量組104.557.5±16.953.4±13.046.8±14.9*36.0±14.4**22.6±11.5**雷公藤多苷片組100.01561.5±18.052.9±16.947.2±17.1*42.4±16.3**27.0±13.1**

表4 給藥后各組大鼠踝關節病理改變評分統計表（±s）

表4 給藥后各組大鼠踝關節病理改變評分統計表（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

組別動物數（只）給藥劑量（g·kg-1·d-1）空白對照組病理評分10--模型組10-13.5±1.581桂芍知母湯高劑量組10181.3±2.767**桂芍知母湯中劑量組1093.2±2.820**桂芍知母湯低劑量組104.55.3±3.164**雷公藤多苷片組100.0150.8±1.687**

表5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比較（±s）pg/mL

表5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比較（±s）pg/mL

注：與空白對照組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別動物數（只）空白對照組給藥劑量（g·kg-1·d-1）10 IL-1IL-6 -IL-17 37.772±15.75586.978±18.2956.353±2.505模型組-88.447±49.774▲▲119.224±24.585▲▲20.902±9.134▲▲10桂芍知母湯高劑量組101848.498±7.433*90.755±21.542*10.093±6.172**桂芍知母湯中劑量組10950.523±10.053*85.882±22.451**10.066±6.184**桂芍知母湯低劑量組104.569.184±33.720103.954±23.50116.112±9.984雷公藤多苷片組100.01539.633±6.766*76.257±2.974**11.785±7.342*

本研究我們發現，自d0起，模型組的關節評分、左右足體積及腫脹度一直保持上升趨勢，而桂芍知母湯各劑量組相關指標則持續下降，直至d16；同時在病理評分方面，桂芍知母湯各劑量組均遠低于模型組，顯示桂芍知母湯可緩解模型動物關節腫脹、變形等癥狀并改善關節病理變化，對模型動物的關節炎癥有較為明顯的治療效果；而桂芍知母湯高、中劑量可明顯減少模型動物滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的含量，提示桂芍知母湯可通過調節IL-1、IL-6及IL-17的表達而起到緩解關節炎癥反應的作用。

［1］張均田.現代藥理學實驗方法.北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998：1383

［2］Klimiuk PA，Yang H，Goronzy JJ，et al.Production of cytokines and metalloproteinases in rheumatoid synovitis is T cell dependent.Clin Immunol，1999，163：491

［3］ArendW.Cytokineimbalanceinhepathogenesisof rheumatoidarthritis：theroleofinterleukin1receptor antagonist.Arthritis Rhrum，2001，30：1

［4］CarterSD，Barnes A，Gilmore WH.Canine rheumatoid arthritis and inflammatory cytokines.Vet Immunol Immunopathol，1999，69（2-4）：201

［5］Veldhoen M，Hocking RJ，Atkins CJ，et al.TGF-β in the context of an inflammatory cytokine milieu supports the enovodifferentiationofIL-17-productingTcells. Immunity，2006，24（2）：179

［6］Chabaud M，Garnero P，Dayer JM，et al.Contribution of interleukin17tosynoviummatrixdestructionin rheumatoid arthritis.Cytokine，2000，12（7）：1092

［7］Komiyama Y，Nakae S，Matauki T，et al.IL-17 plays an importantroleinthedevelopmentofexperimental autoimmune encephalomyelitis.Immunol，2006，177（1）：566

p

R684.305

A

1672-397X（2015）11-0076-04

胡雨峰（1985—），男，博士，講師，中醫內科學專業，風濕免疫病研究方向。

奚飛飛，博士，助理研究員。xifeifei@163.com

2015-08-27

編輯：吳寧

南京中醫藥大學自然科學基金資助項目（13xzr10）；南京中醫藥大學哲學社會科學基金資助項目（13xsk29）；南京中醫藥大學中醫痹病學重點學科開放課題基金項目（BBXK2013104）