硫辛酸對高糖誘導小鼠RIN-m5F細胞保護作用的機制

高翠翠，唐雪，2，藺憶，陳立立，施用暉，2，樂國偉*，2

（1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫214122）

硫辛酸對高糖誘導小鼠RIN-m5F細胞保護作用的機制

高翠翠1，唐雪1，2，藺憶1，陳立立1，施用暉1，2，樂國偉*1，2

（1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫214122）

探究α-硫辛酸（α-LA）對高糖誘導RIN-m5F細胞的保護機制。RIN-m5F細胞分為對照組（11 mmol/L葡萄糖）、葡萄糖損傷組（22 mmol/L或44 mmol/L葡萄糖）、α-LA干預組（上述3個葡萄糖濃度+200 μmol/L α-LA），分別檢測細胞內活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）水平、總抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）活性；BAX、BCL-2、GSK-3β mRNA表達水平；細胞線粒體膜電位及蛋白印跡法檢測GSK-3β和p-Ser9 GSK-3β蛋白質水平。結果表明，與糖損傷組相比，200 μmmol/L α-LA顯著降低胞內ROS水平，分別降低30%和83%；增強細胞SOD活性及T-AOC能力，降低MDA積累；上調抗凋亡因子BCL-2 mRNA表達水平，下調促凋亡蛋白質BAX mRNA表達水平，提高細胞線粒體膜電位。此外，α-LA能夠下調GSK-3β mRNA表達水平，提高p-Ser9 GSK-3β蛋白質水平，表明α-LA對高糖誘導RIN-m5F細胞的抗氧化和抗凋亡保護作用與調節GSK-3β有關。

硫辛酸；葡萄糖；氧化應激；細胞凋亡

高血糖導致的胰島β細胞損傷是糖尿病發生的重要環節，高濃度葡萄糖環境導致細胞內氧化系統與抗氧化系統失衡，從而造成細胞各項功能受損，而胰島β細胞抗氧化酶（如CAT、GPx、SOD）活性相對較低，更易受到氧化損傷而引發糖尿病［1］。

α-硫辛酸（α-LA）在糖尿病及其并發癥的預防及治療中已經有所應用。α-LA與其還原形式二氫硫辛酸（DALA）均具有較強抗氧化作用，可通過直接清除氧自由基、螯合金屬離子如銅和鐵、再生內源性抗氧化劑和修復氧化損傷等途徑減輕機體氧化應激［2-4］。多項研究已經證實α-LA對細胞的保護作用，例如它可以抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡［5］，抑制TNF-a誘導的肝細胞及骨髓基質細胞凋亡［6-7］；也有研究表明α-LA能夠減少自由基對胰島β細胞的損害，對抗凋亡。但是α-LA保護胰島β細胞的具體機制尚未明確［8-9］。

GSK-3β在多種信號傳導過程中起關鍵作用，它不僅通過激活糖原合成酶調節細胞糖代謝及能量代謝過程，而且在細胞生長、分化、突變和凋亡等生命活動中也具有重要的調控作用［10］。研究顯示，GSK-3β是胰島細胞增殖分化的限速酶。正常小鼠敲除GSK-3β可提高胰島β細胞功能，飼喂高脂日糧后仍具有正常的葡萄糖耐受能力及胰島功能［11］。姜黃素可以通過增加GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制GSK-3β活性，對抗Aβ導致的線粒體代謝缺陷和氧化應激［12］。此外，LA可通過增加p-GSK-3β水平保護活性氮介導的心肌細胞損傷［13］，抑制GSK-3β表達，對抗BV-2細胞炎癥反應［14］。

目前，α-LA對胰腺β細胞抗氧化保護作用是否與GSK-3β有關，尚未有報道。因此，本研究以胰島素瘤細胞株（RIN-m5F）為對象，探究α-LA可能的抗氧化機制，以期為I型糖尿病的防治提供有價值的理論依據。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

小鼠胰島素瘤細胞系RIN-m5F，江南大學藥學院金堅教授饋贈。RPMI 1640培養基，胎牛血清，GIBCO公司產品；α-LA（純度99%），江蘇富士萊醫藥化工有限公司產品；DCFH-DA熒光探針試劑盒，JC-1線粒體膜電位測定試劑盒，碧云天生物公司產品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所研制；Trizol，熒光染料SBY，美國Biomiga公司產品；M-MLV逆轉錄酶，Promega公司產品；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司產品；兔抗鼠GSK-3β抗體，p-Tyr216GSK-3β抗體，p-Ser9GSK-3β抗體，美國Cell Sinaling公司產品；其他試劑均為國產分析純試劑。Spectra Max M5/M5e酶標儀，美國Molecular Devices公司制造；7900HT Fast Real-Time PCR儀，美國ABI公司制造；FACS Calibur流式細胞儀，美國Becton Dickinson公司制造；Fluor Chem FC3型化學發光成像分析系統，美國Protein Simple公司制造。

1.2細胞培養

RIN-m5F培養于含體積分數10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃和體積分數5%CO2培養箱中培養，待細胞長至80%～90%融合時，以質量分數0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2體積比傳代培養。

1.3實驗分組及處理

細胞貼壁長至50%體積時，分別轉入不同條件培養基繼續培養72 h。實驗分組：對照組（11mmol/L葡萄糖）；糖損傷組（22 mmol/L葡萄糖，44 mmol/L葡萄糖）；α-LA干預組（11 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，22 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，44 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA）。

1.4活性氧自由基（ROS）測定

細胞接種于96孔板，分組及處理同上。去除培養液，加入稀釋好的DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，37℃培養箱內孵育30 min，用無血清培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA。M5熒光酶標儀檢測熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.5氧化應激指標的測定

取對數生長期的細胞接種于6孔板，分組及處理同上。預冷磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L PBS）清洗細胞2次，RPMI細胞裂解液于冰上裂解細胞5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存待測。

嚴格按照試劑盒說明書測定細胞裂解液中相關指標：MDA、SOD、T-AOC。

1.6細胞線粒體膜電位測定

取對數生長期的細胞接種于6孔板，分組及處理同上。嚴格按照JC-1線粒體膜電位試劑盒說明書測定，實驗獨立重復3次。

1.7Real-Time PCR檢測細胞內相關基因mRNA表達水平

Trizol法提取細胞總RNA，取2.0 μg總RNA，經反轉錄為cDNA（20 μL反應體系），-20℃保存。PCR擴增條件：預變性95℃，5 min；變性95℃20 s，退火62℃30 s，延伸72℃20 s，所有基因均為40個循環；終末延伸72℃2 min。基因引物上下游序列及退火溫度見表1。

表1　引物序列及退火溫度Table 1　Sequences of the primers and annealing temperature

1.8Western-blot檢測GSK-3β蛋白質水平

各組細胞抽提蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度。各組樣品按40 μg/孔點樣，質量分數12.5% SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，半干法轉蛋白質至PVDF膜。體積分數5%BSA TBST液在室溫條件下封閉60 min。GSK-3β抗體（體積比1∶1 000）、p-Ser9GSK-3β抗體（體積比1∶1 000），4℃孵育過夜。洗滌后二抗室溫孵育60 min。顯色，成像，電泳圖像分析系統分析。

1.9數據處理與統計方法

采用SPASS17.0統計軟件對數據進行相關性分析，并作Duncan多重比較。實驗數據用x±SD表示，顯著水平為P＜0.05。

2　結果與分析

2.1α-LA對細胞內ROS的影響

隨著葡萄糖濃度的增加，細胞ROS水平逐漸升高，且差異顯著（P＜0.05）；添加200 umol/L α-LA可顯著降低22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組ROS水平（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖組可恢復至正常水平。如圖1所示。

圖1　各組細胞存活率及ROS水平的影響Fig.1　Influence of α-LA on ROS and the viability of RIN-m5F treated with glucose

2.2細胞SOD活性、MDA水平以及T-AOC的變化

隨著葡萄糖濃度的增加，細胞內MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、T-AOC顯著降低（P＜0.05）；而α-LA干預可顯著提高各組SOD活性（P＜0.05），22 mmol/L葡萄糖+α-LA組可恢復至正常水平；此外，添加α-LA后可提高22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組T-AOC水平，降低MDA含量（P＜0.05），表明LA可有效降低高糖引起的氧化應激，見表2。

2.3細胞BAX和BCL-2 mRNA表達水平的變化

隨著葡萄糖濃度的增加，BAX mRNA表達水平顯著上調（P＜0.05），BCL-2 mRNA表達水平顯著下調（P＜0.05）；添加α-LA后可在一定程度恢復22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組BCL-2表達水平，降低BAX表達水平（P＜0.05），表明LA具有一定的抗凋亡作用，如圖2所示。

表2　各組細胞MDA、SOD和T-AOC水平的比較Table 2　Effects ofα-LA on MDA content，SOD activities and T-AOC in RIN-m5F treated with glucose

圖2　各組細胞BAX-2mRNA表達的變化Fig.2　Expression of BAX-2 gene in different groups

2.4線粒體膜電位變化

隨著葡萄糖濃度的增加，線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05）；α-LA干預后，各組相比損傷組線粒體膜電位均有顯著升高（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖+α-LA組可恢復至正常水平，如圖3、4所示。

2.5α-LA干預對GSK-3β mRNA表達水平及蛋白質磷酸化水平的影響

α-LA對各組細胞GSK-3β基因水平的影響如圖5所示，GSK-3β mRNA表達水平隨葡萄糖濃度增加而提高（P＜0.05）；α-LA干預可顯著降低糖損傷組GSK-3β mRNA表達水平，其中22 mmol/L葡萄糖組可下調至正常水平。

Western-blot檢測細胞GSK-3β磷酸化水平，結果如圖6和圖7所示，隨著葡萄糖濃度的升高，GSK-3β Ser9位點磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；α-LA干預后，相比損傷組Ser9位點磷酸化水平均有顯著升高（P＜0.05）。

3　討論

Brownlee的統一機制學說認為，在高糖環境，線粒體呼吸鏈生成過多氧自由基可激活晚期糖基化終末產物途徑、多元醇途徑，以及蛋白激酶C途徑，后者反過來又能促進自由基的生成，形成惡性循環［15］。

圖3　α-LA對RIN-m5F細胞線粒體膜電位的影響Fig.3　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

圖4　α-LA對RIN-m5F細胞線粒體膜電位的影響Fig.4　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

圖5　各組細胞GSK-3β mRNA表達的變化Fig.5　Expression of GSK-3β gene in different groups

圖6　western-blot檢測各組細胞p-GSK-3β蛋白水平表達Fig.6　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

圖7　western-blot檢測各組細胞p-GSK-3β蛋白表達灰度值Fig.7　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

胰島β細胞功能紊亂是糖尿病發生的中心環節，由于β細胞抗氧化系統處于較低水平，使其更易發生氧化應激，誘導細胞凋亡及胰島素分泌功能降低［16］。正常生理狀況下，胞內ROS生成和清除處于動態平衡，ROS過多生成引起細胞氧化損傷。

MDA是細胞膜脂質被活性氧氧化的產物，是評價氧化損傷程度的重要標志物，其過度累積可直接反映受氧化應激損傷的程度［17］。SOD是細胞受到外界刺激產生的內源性抗氧化酶類，可以清除活性氧物質，對維持氧化與抗氧化平衡起著重要作用，通過檢測SOD活性可間接反映胞內氧化應激水平［18］。本研究中以11、22、44 mmol/L葡萄糖分別孵育RIN-m5F細胞72 h，發現高糖可誘導細胞產生氧化應激，且與糖濃度呈正相關。200 μmol/L α-LA干預可使高糖組細胞MDA和ROS生成顯著降低，SOD活性及T-AOC水平顯著升高。表明α-LA對RIN-m5F細胞的抗氧化保護作用，與調節抗氧化酶活性、增強總抗氧化能力有關。

糖原合成酶激酶GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在生物體內參與多種蛋白質的轉錄與激活，以及調控細胞增殖、分化和凋亡等生命活動的信號轉導，具有廣泛的細胞調節作用。研究發現，ROS升高導致GSK-3β Ser9位點磷酸化水平降低，從而激活GSK-3β，造成線粒體內Ca2+外流，線粒體膜電位改變，PTP通道打開。激活后的GSK-3β能夠促進線粒體促凋亡蛋白質BAX表達［10］。BAX是BCL-2家族的重要蛋白質之一，正常條件下BCL-2與BAX形成異源二聚體，抑制BAX的功能。當BCL-2減少時，釋放出來的BAX形成同源二聚體，在線粒體外膜形成足夠讓凋亡蛋白質傳輸的孔道，使線粒體膜電位破壞，造成線粒體膜電位下降，誘導細胞凋亡。王俐［19］等研究發現，α-LA可以抑制高糖誘導的ECV304細胞線粒體膜電位降低，保護細胞免受氧化損傷。Yoshiki Koriyama［14］等指出，LA可以通過抑制GSK-3β的表達對抗BV-2細胞炎癥反應，為神經病變性疾病提供依據。但α-LA能否調節胰島細胞GSK-3β活性，尚未見相關報道。本研究結果顯示，高糖可以顯著誘導RIN-m5F細胞凋亡，上調GSK-3β mRNA表達水平，下調GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平，激活GSK-3β活性；α-LA干預后，GSK-3β mRNA水平顯著下調，GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平顯著上調，并且伴隨Bax mRNA表達水平下調及BCL-2 mRNA水平上調，線粒體膜電位顯著升高，其中200 μmol/L α-LA可使22 mmol/L葡萄糖組各項指標恢復至正常水平。表明α-LA可能通過抑制GSK-3β活性調節線粒體BCL-2表達，從而抑制BAX釋放，進而提高線粒體膜電位，抑制高糖誘導的細胞凋亡，維護細胞氧化還原穩態。

4　結語

綜上，推測GSK-3β可能是α-LA保護高糖損傷胰島細胞的一個重要信號分子，α-LA可能通過提高GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制其活性，從而降低促凋亡蛋白質表達，提高線粒體膜電位，維護RIN-m5F細胞氧化還原穩態。

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Cytoprotective Effect of α-Lipoic Acid on RIN-m5F Cultured with High Glucose

GAO Cuicui1，TANG Xue1，2，LIN Yi1，CHEN Lili1，SHI Yonghui1，2，LE Guowei*1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The aim of this study is to investigate whether α-lipoic acid（α-LA）prevents high glucose-induced oxidative damage and apoptosis of pancreatic islet beta cells.In the present sudy，RIN-m5F cells were incubated with different concentration of glucose（11 mmol/L，22 mmol/L and 44 mmol/L）in the presence or absence of 200 μmol/L α-LA for 72 h.Then，cellular reactive oxygen species（ROS）levels，malandialdehyde（MDA）levels，total antioxidant capacity（T-AOC）and superoxide dismutase（SOD）activity were assayed with the appropriate test kits；mitochondrial membrane potential was detected by flow cytometry；relative genes levels were analyzed by reverse transcriptase polymerase chain reaction；western blotting was used to determine protein expression of GSK-3β and p-GSK-3β（Ser9）.The results show that α-LA significantly reduced the MDAformation and inhibited the ROS production induced by high glucose，whereas increased T-AOC and SOD activity.Additionally，α-LA induced membrane depolarization and increased mitochondrial membrane potential.These effects were mediated by Bcl-2 associated X protein（BAX）and B-cell lymphoma-2（BCL-2）expression.Western blotting indicated that α-LA inhibited GSK-3β by increasing p-GSK-3β（Ser9）level.Therefore，our data suggest that α-LA can effectively attenuate high glucose-induced RIN-m5F cell oxidative damage and apoptosis，by mechanisms which probably involves the inactivation of GSK-3β by phosphorylation.These findings provide a new interpretation on the role of α-LA in the treatment of diabetes.

α-lipoic acid，glucose，oxidative stress，apoptosis

TS 201.2

A

1673—1689（2015）09—0949—07

2014-06-04

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

樂國偉（1956—），男，浙江寧波人，農學博士，教授，博士研究生導師，主要從事營養代謝與調控研究。E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn