響應(yīng)面優(yōu)化水提取燕麥抗真菌蛋白的研究

蘇日娜，張美莉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

響應(yīng)面優(yōu)化水提取燕麥抗真菌蛋白的研究

蘇日娜，張美莉*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

以裸燕麥籽粒為原料，利用水提取燕麥蛋白中的抗真菌蛋白（antifungal protein），用打孔法觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，探討提取時(shí)間、提取溫度、pH以及液料比對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響，確定燕麥抗真菌蛋白的最佳水提工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)提取時(shí)間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12∶1mL/g時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大為18.10mm。

燕麥，抗真菌蛋白，水提取法，響應(yīng)面分析法

植物病害是病原真菌侵染所引致的［1］。真菌病害會(huì)導(dǎo)致糧食作物減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)作物品質(zhì)降低。然而，在長(zhǎng)期生長(zhǎng)進(jìn)化的過(guò)程中，高等植物其自身常產(chǎn)生一些物質(zhì)來(lái)與外源侵襲物對(duì)抗，抗真菌蛋白就是其中的一類(lèi)，他們可以抑制真菌生長(zhǎng)或殺死真菌。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗真菌蛋白還具有抑制HIV病毒反轉(zhuǎn)錄的功能［2-3］。抗真菌蛋白可以作為天然食品防腐劑，憑借其抗菌性強(qiáng)、安全、無(wú)毒等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注［4］。因此從食源性材料中提取抗真菌蛋白是未來(lái)研制天然食品防腐劑的一個(gè)趨勢(shì)。目前，已經(jīng)從多種食源性材料中提取到抗真菌蛋白，如苦蕎、黑麥、豌豆、蘿卜、香蕉等［5-9］，但是關(guān)于燕麥中提取抗真菌蛋白從未報(bào)道。

燕麥，又被稱(chēng)為莜麥、玉麥、雀麥、鈴鐺麥，其蛋白質(zhì)含量在所有谷物中最高［10］。燕麥蛋白質(zhì)含有18種氨基酸，其必需氨基酸組成合理、全面，特別含有谷物類(lèi)普遍缺乏的氨基酸，含量高達(dá)約0.68g/100g，是大米和小麥的2倍以上，是其他糧食作物所不及的。相關(guān)研究表明燕麥同時(shí)具有降血脂、降血糖、免疫增強(qiáng)、抗氧化、益生等多種保健功能［11-13］。本實(shí)驗(yàn)以裸燕麥為原料，利用水提取法，研究在水提取過(guò)程中抑真菌活性的變化，確定水提取燕麥抗真菌蛋白的最佳工藝條件，以期為深入加工、開(kāi)發(fā)燕麥蛋白資源提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

裸燕麥籽粒吉林白城農(nóng)科院提供；鏈格孢菌內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害與保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保藏；無(wú)水乙醚國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；G-250考馬斯亮藍(lán)北京金銳林有限公司；牛血清白蛋白北京金銳林有限公司。

HH-6型電子恒溫水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司；PB-10型酸度計(jì)美國(guó)賽多利斯公司；真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；粉碎機(jī)浙江高鑫工貿(mào)有限公司；SIGMA 3-18k型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)SIGMA公司；超凈臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-80BSH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1燕麥抗真菌蛋白樣品制備工藝流程裸燕麥籽粒→粉碎→過(guò)80目篩→索式抽提脫脂→自然干燥（12h）→加入超純水→攪拌浸提→4℃、10000r/min離心10min→取上清液→冷凍干燥→燕麥水提取蛋白凍干粉。

1.2.2燕麥抗真菌蛋白水提取法單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1提取時(shí)間對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準(zhǔn)確稱(chēng)取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到7.0，在30℃水浴分別攪拌浸提8、10、12、14、16h，測(cè)量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.2提取溫度對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準(zhǔn)確稱(chēng)取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到7.0，分別在20、25、30、35、40℃的水浴中攪拌浸提12h，測(cè)量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.3pH對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準(zhǔn)確稱(chēng)取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在30℃水浴中攪拌浸提12h，測(cè)量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.4液料比對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準(zhǔn)確稱(chēng)取5g脫脂燕麥粉，調(diào)節(jié)pH到7.0，分別以液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1mL/g，在30℃水浴中攪拌浸提12h，測(cè)量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.3水提工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert中的Box—Behnken設(shè)計(jì)，確定對(duì)抑菌圈大小有影響的四個(gè)因素。以提取時(shí)間、提取溫度、pH、液料比為自變量，選取抑菌圈直徑作為響應(yīng)變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in responses surface analysis

1.2.4提取液蛋白得率的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［14］，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的吸光度A為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取0.05mL燕麥提取蛋白液，準(zhǔn)確加入蒸餾水至1mL，再加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，靜置2min，測(cè)定595nm處吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可得燕麥提取液蛋白含量。參比為1mL蒸餾水加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。

蛋白得率（mg/g）=提取液蛋白質(zhì)量（mg/mL）/原料總質(zhì)量（g）×提取液總體積（mL）

1.2.5抑菌圈的測(cè)定

1.2.5.1打孔法以鏈格孢菌作為指示菌，將鏈格孢菌接種到馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基中心，用滅過(guò)菌的打孔器在平皿上十字對(duì)稱(chēng)打四個(gè)孔，打孔直徑為6mm。在三個(gè)孔中分別加入20μL的濃度為50mg/mL的燕麥水提取蛋白樣品，一個(gè)孔作為空白對(duì)照加入20μL的滅菌蒸餾水，將培養(yǎng)基平穩(wěn)地置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，三個(gè)平行樣。

1.2.5.2抑菌圈直徑的測(cè)量方法在反射光的照射條件下用游標(biāo)卡尺在培養(yǎng)皿背面測(cè)量抑菌圈直徑，垂直測(cè)量三次，取平均值［15］。

1.2.6數(shù)據(jù)處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)三次平行實(shí)驗(yàn)得到的平均值，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著分析等。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液測(cè)定曲線(xiàn)

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。如圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=4.3083x+0.3823（R2=0.9971）。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve

圖2　提取時(shí)間對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1提取時(shí)間對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖2可知，提取時(shí)間在8～12h的范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的不斷增加，抑菌圈直徑和蛋白得率逐漸變大，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)12h時(shí)，抑菌圈直徑和蛋白得率都達(dá)到了最大。在此之后，隨著提取時(shí)間增加，抑菌圈直徑和蛋白質(zhì)得率開(kāi)始降低。這是因?yàn)樘崛r(shí)間會(huì)影響到溶劑與燕麥中抗真菌蛋白的接觸與溶解。但是浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起燕麥中抗真菌蛋白抑菌性下降。所以選擇12h為響應(yīng)面時(shí)間因素的中心值。

2.2.2提取溫度對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，抑菌圈直徑和蛋白得率也隨之增大，溫度達(dá)到30℃時(shí)，蛋白得率達(dá)到了最大。此時(shí)，該提取溫度為燕麥中抗真菌蛋白溶出的最適溫度，所以抑菌性也達(dá)到了最大。所以選擇30℃為響應(yīng)面的中心值。

圖3　提取溫度對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2.3pH對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖4可知，pH從6.0～7.0時(shí)，抑菌圈直徑緩慢增大，當(dāng)pH達(dá)到7.5時(shí)達(dá)到最大，抑菌圈直徑為17.72mm。而蛋白得率隨著pH的增大逐漸增大，pH為7.5時(shí)達(dá)到最大。這可能是因?yàn)檠帑溈拐婢鞍诪橐环N偏堿性蛋白，過(guò)酸或過(guò)堿的條件下，會(huì)造成燕麥抗真菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響了抑菌效果。所以，選擇7.5為響應(yīng)面中心值。

圖4　pH對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.4　Effect of pH on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2.4液料比對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖5可知，隨著液料比增大，抑菌圈直徑逐漸變大，當(dāng)液料比為10∶1mL/g時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到了最大，但在液料比增至15∶1mL/g后，液料比對(duì)抑菌圈直徑影響不大。而蛋白得率一直呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)橐毫媳冗^(guò)小可能會(huì)影響到燕麥中抗真菌蛋白的溶解情況，而液料比過(guò)大又會(huì)減少蛋白質(zhì)含量，導(dǎo)致抑菌性下降，造成原料的浪費(fèi)。所以，選擇液料比10∶1mL/g作為響應(yīng)面中心值。

圖5　液料比對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.5　Effect of liquid-to-solid ratio on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2　響應(yīng)曲面法優(yōu)化水提條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Experimental design and results for responses surface analysis

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis for antifungal activity

圖6　溫度和時(shí)間對(duì)對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.6　Extraction temperature and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activity

圖7　液料比與時(shí)間對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.7　Liquid-to-solid ratio and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activity

圖8　pH與時(shí)間對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.8　pH and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activit

圖9　pH與溫度對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.9　pH and extraction temperature showing the effects on oat protein antifungal activity

圖10　液料比與溫度對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.10　Liquid-to-solid ratio and extraction temperature showing the effects on oat protein antifungal activity

其二次方程為：

Y=18.02+1.23A-0.61B+0.33C+1.50D-0.61AB+ AC+0.71AD+0.54BC-0.63BD-0.13CD-4.80A2-3.03B2-2.26C2-2.12D2

對(duì)建立的模型進(jìn)行方差分析，由表3的方差分析結(jié)果可以看出，模型p值極顯著。失擬p=0.0724＞0.05，不顯著。說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小。R2= 0.9430，說(shuō)明該模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)A、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性影響均達(dá)到了極顯著（p＜0.01）水平。模型可以看出各個(gè)因素對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性影響的大小順序：液料比（D）＞提取時(shí)間（A）＞提取溫度（B）＞pH（C）。

2.4響應(yīng)面結(jié)果分析

由圖6～圖11可以看出，提取時(shí)間與pH交互作用顯著，其余各因素之間交互作用都很小。根據(jù)模型優(yōu)化的最佳水提條件：提取時(shí)間12.35h，提取溫度29.24℃，pH7.54，液料比12.01mL/g，抑菌圈直徑18.49mm。

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合實(shí)際條件，最終選擇的實(shí)驗(yàn)條件：提取時(shí)間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12mL/g，進(jìn)行三組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得出實(shí)際數(shù)值為18.10mm與預(yù)測(cè)值18.49mm的差異為0.02%，說(shuō)明該回歸方程能夠比較真實(shí)的反映各因素對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響。證明響應(yīng)面優(yōu)化提取條件真實(shí)可靠。

圖11　液料比與pH對(duì)燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應(yīng)曲面Fig.11　Liquid-to-solid ratio and pH showing the effects on oat protein antifungal activity

圖12　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.12　Validation of the optimized process conditions

3　結(jié)論

水提取燕麥抗真菌蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時(shí)間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12∶1mL/g。在此條件下，抑菌圈直徑達(dá)到18.10mm，與預(yù)測(cè)值18.49mm的差異為0.02%。證明響應(yīng)面優(yōu)化水提取燕麥抗真菌蛋白的條件是合理可靠的。該研究結(jié)果對(duì)燕麥抗真菌蛋白的進(jìn)一步分離、純化提供了理論基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)只選取一種菌作為指示菌，代表性不強(qiáng)，后續(xù)的工作應(yīng)系統(tǒng)地研究燕麥抗真菌蛋白的抑菌活性。

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Study on the optimization of water extraction of oat antifungal protein by response surface anaylsis

SU Ri-na，ZHANG Mei-li*
（Food Science and Engineering College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Antifungal proteins were extracted from seeds of naked oat by water extraction method.The antifungal activity of the protein was evaluated by hole method.Based on single factor method，response surface analysis were used to explore the effects of extraction time，extraction temperature，pH and liquid-to-solid ratio on antifungal activity of oat antifungal protein.These methods determined the optimal water extraction conditions of oat antifungal protein.Results：The optimal extraction time，extraction temperature，pH and liquid-to-solid ratio were 12h，30℃，7.5，12∶1mL/g.The actual maximum diameter of inhibition zone was 18.10mm.

oat；antifungal protein；water extraction method；response surface anaylsis

TS213.3

B

1002-0306（2015）14-0312-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.055

2014－12－08

蘇日娜（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：植物活性成分的分離純化。

張美莉（1966-），女，博士，教授，研究方向：植物活性成分的分離純化。