火炭母總黃酮的提取和抗氧化活性研究

董艷輝

（廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

火炭母總黃酮的提取和抗氧化活性研究

董艷輝

（廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

對火炭母總黃酮的提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行了研究。在單因素實驗的基礎(chǔ)上考察了料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度對總黃酮提取的影響，再通過正交實驗確定提取的最佳工藝為：料液比1∶50g/mL、乙醇濃度50%、提取溫度70℃、提取時間20min。在此條件下，火炭母總黃酮的提取率為4.28%。抗氧化結(jié)果表明，火炭母黃酮具有較強的還原能力，對DPPH·和OH·兩種自由基具有明顯的清除能力，且在實驗濃度范圍內(nèi)清除率與濃度呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，半數(shù)有效濃度EC50分別為0.00519、0.150mg/mL。

火炭母，總黃酮，提取，抗氧化活性

黃酮類化合物具有多種多樣的生物活性，一方面通過其清除自由基的作用，直接抑制癌細(xì)胞的生長、從而提高機體免疫力而實現(xiàn)抗癌、防癌的作用，另一方面，該類化合物還能有效地阻止脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞破壞，起到天然抗氧化劑的功效［1］。近年來，黃酮類化合物在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，從我國豐富的植物資源中開發(fā)利用黃酮類化合物已成為了研究熱點［2-6］。

火炭母為蓼科蓼屬植物火炭母的干燥全草，具有清熱利濕、涼血解毒、平肝明目、活血通絡(luò)等功效，是嶺南地區(qū)常用的一味中草藥，也是多種涼茶如“廣東涼茶”、“王老吉”及“二十四味”等的主要組成藥物之一。火炭母主要化學(xué)成分為黃酮類、鞣質(zhì)類、甾醇類等［7-8］。韋玉、朱華等對不同產(chǎn)地火炭母的總黃酮和槲皮素含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)火炭母含有豐富的黃酮和槲皮素［9-10］。黃國霞以甲醇為溶劑對火炭母的活性成分進(jìn)行了提取，并且采用H2O2/Fe3＋體系法和鄰苯三酚體系法對提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，所得結(jié)果顯示火炭母甲醇提取液具有一定的抗氧化作用［11］。本研究以乙醇為溶劑，利用超聲波輔助提取火炭母中的總黃酮，通過還原能力及清除自由基的能力考察火炭母總黃酮的抗氧化活性，旨在找到最佳的提取工藝及了解其抗氧化活性，以便人們對火炭母有更充分的認(rèn)識，從而使其開發(fā)利用更加科學(xué)合理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

火炭母中山市中智大藥房；蘆丁對照品中國藥品生物制品檢定所（批號：100080-200707）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·） Sigma公司；其他試劑均為市售分析純；實驗用水蒸餾水。

UV1100紫外可見分光光度計上海天美公司；AUY220萬分之一電子天平日本島津公司；KQ3200 VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司。

1.2火炭母總黃酮的提取

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制總黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用無水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得到0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密移取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于10mL容量瓶中，加水至5.0mL，加5%亞硝酸鈉0.4mL放置6min，加10%硝酸鋁0.4mL放置6min，再加4%氫氧化鈉4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。以第1瓶為空白對照，于510nm波長下測定各溶液吸光度，吸光度（A）與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝11.702C+0.0098，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

1.2.2火炭母黃酮的提取火炭母經(jīng)干燥粉碎后過60目篩，稱取預(yù)處理后的火炭母粉末1.000g于具塞錐形瓶中，在不同條件下進(jìn)行超聲提取，提取液濾過后定容至100.0mL。精密移取已定容的火炭母提取液1mL于10mL容量瓶中，同1.2.1項測定方法，以試劑空白為參比液，于510nm波長處測定吸光度，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出黃酮提取率。

式中，A為吸光度；m為火炭母質(zhì)量，g。

1.2.3單因素實驗控制反應(yīng)條件為溫度40℃、乙醇濃度70%、超聲提取時間30min，考察料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60g/mL時的黃酮提取率。控制反應(yīng)條件為溫度40℃、料液比1∶50g/mL、超聲提取時間30min，考察乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%時的黃酮提取率。控制反應(yīng)條件為溫度40℃，料液比為1∶50g/mL，乙醇濃度40%，考察提取時間分別為10、20、30、40、50、60min時的黃酮提取率。控制反應(yīng)條件為料液比1∶50g/mL、乙醇濃度40%、超聲提取時間20min，考察超聲提取溫度分別為30、40、50、60、70℃時的黃酮提取率。

1.2.4正交實驗設(shè)計在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間為實驗因素，以黃酮提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計四因素3水平正交實驗，具體方案見表1。正交實驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，進(jìn)一步篩選優(yōu)化總黃酮提取工藝條件。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.3火炭母黃酮抗氧化性活性的測定

1.3.1還原能力實驗本實驗用的是鐵氰化鉀法［12］。精密移取火炭母提取液1mL，加入2.5mL（pH6.6，0.2mol/L）磷酸緩沖液和2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃恒溫水浴20min，迅速冷卻，加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸餾水，加入0.5mL 0.1%三氯化鐵，靜置10min，于700nm波長處測吸光度。以VC作陽性對照實驗。

1.3.2DPPH·清除實驗DPPH·清除能力的測定參考Enayat S［13］方法：精確稱取DPPH·7.8mg，用無水乙醇溶解并定容至100mL棕量瓶，避光保存，其濃度為2×10-4mol/L。將各組反應(yīng)液加入10mL容量瓶中，混勻，于室溫、避光處靜置30min后，分別測定其在517nm波長下的吸光度，按照下式計算DPPH·的清除率，并計算樣液清除DPPH·的半數(shù)有效濃度EC50。用VC作為對照。

式中，Ai為2mL DPPH·+2mL黃酮提取液的吸光度；Aj為2mL無水乙醇+2mL黃酮提取液液的吸光度；Ao為2mL DPPH·+2mL無水乙醇的吸光度。

1.3.3OH·清除實驗清除羥自由基的能力的測定用水楊酸捕獲法［14］。測定時于若干比色管中加入2mmol/L FeSO4溶液1mL，6mmol/L水楊酸-乙醇1mL，黃酮提取液1mL（空白對照以蒸餾水代替總黃酮提取液），最后再加入6mmol/L H2O21mL啟動反應(yīng)，37℃水浴30min，在510nm測定吸光度，實驗重復(fù)3次，求其平均值。由于樣液本身具有吸光度，測其本底值時用蒸餾水代替過氧化氫，根據(jù)下式計算羥自由基清除率，并計算樣液清除的半數(shù)有效濃度EC50。用VC作為對照。

式中，Ax為加入黃酮提取液后吸光度；Axo樣液本底吸光度，未加顯色劑H2O2；Ao為空白對照吸光度。

圖1　料液比對火炭母黃酮提取率的影響Fig.1　The effect of material-liquid ratio on extracion rate for total flabonoids from Polygonum chinense

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1液料比對火炭母黃酮提取率的影響由圖1可知，在料液比低于1∶50g/mL時，提取率隨料液比的增加整體呈上升趨勢，當(dāng)料液比繼續(xù)增加，總黃酮提取率不斷下降。根據(jù)萃取理論，黃酮的溶出與萃取液的濃度梯度有關(guān)。料液比越高，梯度越大，溶出率越高。在一定范圍內(nèi)，溶劑量的增加，顆粒內(nèi)的黃酮化合物分子與溶劑接觸幾率增加，火炭母總黃酮溶出的幾率也相應(yīng)增加，總黃酮提取率就會不斷提高，料液比為1∶50g/mL時，火炭母黃酮提取率達(dá)到最大值。當(dāng)料液比達(dá)到一定數(shù)值后，超聲波的空化作用對火炭母粉末細(xì)胞破裂輔助程度有所下降，且火炭母黃酮類化合物分子的溶出也相應(yīng)接近飽和，從而導(dǎo)致總黃酮提取率下降。料液比越高乙醇的消耗量越大導(dǎo)致濃縮時間變長。考慮到提取效率、溶劑成本選擇1∶50g/mL為最佳料液比。

2.1.2乙醇濃度對火炭母黃酮提取率的影響由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮提取量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，在乙醇濃度為40%時提取量達(dá)到最高，之后又逐漸降低。根據(jù)有機溶劑“相似相溶原理”，黃酮的溶出度與溶劑的極性和本身的極性相關(guān)，極性相似可達(dá)到最大溶出度。開始時提高乙醇濃度增加了溶劑對物料的滲透性和對細(xì)胞膜的破壞性，從而提高了火炭母黃酮化合物的溶解度，乙醇濃度為40%時原料提取比較完全。當(dāng)乙醇濃度超過40%時，總黃酮提取率降低，這可能是因為超聲波提取要求溶劑有一定的含水量，水分過低不利于超聲波發(fā)揮作用，而且高濃度的乙醇也會使一些醇溶性色素和雜質(zhì)溶出。乙醇濃度過低，提取不完全，提取率低；乙醇濃度過高，使其他醇溶性雜質(zhì)的溶出增大，有效成分溶出減少。因此40%乙醇濃度最佳。

圖2　乙醇濃度對火炭母黃酮提取率的影響Fig.2　The effect of ethanol concentration on extraction rate for total flavonoids from Polygonum chinense

2.1.3提取時間對樣品黃酮提取率的影響由圖3可知，在其他條件一定的情況下，提取時間不同，黃酮提取率也不同，當(dāng)提取時間為20min時，黃酮提取率最高，為4.13%。提取時間過短，超聲波能量沒有與火炭母顆粒內(nèi)部分子充分作用，故火炭母總黃酮不能充分溶出，隨著提取時間的延長提取率從最大開始緩慢下降，可能是因為超聲時間過長，使整個體系溫度過高，從而導(dǎo)致火炭母黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)被破壞。因此，20min為最佳提取時間。

2.1.4提取溫度對樣品黃酮提取率的影響由圖4可知，隨著溫度的升高，總黃酮提取率也隨之增高，溫度升至70℃時，黃酮提取最高。隨著提取溫度的升高，分子的運動速度加快，有效成分滲透和溶解速度加快，有利于總黃酮的溶出，有利于提取率的提高。但溫度過高可能造成黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，同時雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便，還會造成溶劑損失。因此，可將超聲溫度控制在70℃以內(nèi)。

圖3　提取時間對火炭母黃酮提取率的影響Fig.3　The effect of extraction time on the extraction rate for total flavonoids from Polygonum chinense

圖4　提取溫度對火炭母黃酮提取率的影響Fig.4　The effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from Polygonum chinense

表2　正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　Ddesign and results of orthogonal test

2.2正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表2。四個因素的極差排列順序為RB＞RC＞RD＞RA，最佳工藝組合為A2B3C3D2，即料液比1∶50g/mL、乙醇濃度50%、提取溫度70℃、提取時間20min，在此條件下，平行3次驗證實驗，測得火炭母總黃酮的提取率為4.28%。

2.3火炭母黃酮抗氧化活性的結(jié)果

2.3.1還原能力的測定結(jié)果還原能力的強弱，可以反應(yīng)藥物的潛在抗氧化性能，是體外抗氧化的一個重要指標(biāo)，吸光度越大，還原力越強。在濃度0.02～0.10mg/mL范圍內(nèi)，分別對火炭母黃酮和VC進(jìn)行還原能力的測定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，火炭母黃酮的還原能力與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相同濃度的火炭母黃酮的還原能力均比VC弱，當(dāng)火炭母黃酮為0.0716mg/mL時，和0.049mg/mL的VC還原能力相當(dāng)，表明火炭母黃酮具有較強的還原能力。

圖5　火炭母總黃酮的還原能力Fig.5　Reduction ability of total flavonoids from Polygonum chinense

2.3.2DPPH·的清除能力結(jié)果由圖6可知，在低濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率呈線性增長，當(dāng)火炭母黃酮濃度為0.012mg/mL時，清除率達(dá)到80.95%，隨后清除率緩慢增長，表明此時溶液中大部分的DPPH·均被清除。在低濃度范圍內(nèi)，火炭母提取液的DPPH·清除效果均比抗壞血酸好，濃度為0.016mg/mL時兩者清除率基本相當(dāng)，經(jīng)過計算得出火炭母黃酮清除DPPH·的半數(shù)有效濃度EC500.00519mg/mL，VC的EC50= 0.00953mg/mL。

圖6　火炭母總黃酮和VC對DPPH·的清除能力Fig.6　The scavenging activity of total flavonoids from Polygonum chinense and VCagainst DPPH·

2.3.3OH·的清除能力結(jié)果自由基是人體中最活潑，對人體危害最大的自由基［15］。火炭母黃酮和VC對羥自由基的清除率結(jié)果見圖7。由圖7可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，火炭母黃酮對OH·的清除作用始終表現(xiàn)為濃度依賴性，隨著濃度的增大而升高，當(dāng)濃度達(dá)到1.0mg/mL時，火炭母黃酮的OH·清除率為97.33%，其清除OH·能力十分顯著。經(jīng)過計算得出火炭母黃酮清除OH·的半數(shù)有效濃度EC50=0.150mg/mL，VC的EC50=0.479mg/mL。

圖7　火炭母總黃酮和VC對OH·的清除能力Fig.7　The scavenging activity of total flavonoids from Polygonum chinense and VCagainst OH·

3　結(jié)論

采用乙醇浸提和超聲波結(jié)合的方法提取火炭母黃酮，確定了提取的最佳工藝條件：料液比1∶50g/mL、乙醇濃度50%、提取溫度70℃、提取時間20min，在此條件下提取率可達(dá)4.28%。抗氧化性實驗表明，火炭母中黃酮化合物具有良好的還原能力和清除DPPH·、OH·的能力，在實驗濃度范圍內(nèi)抗氧化能力和濃度呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。綜上，火炭母是具有潛力的天然氧化劑資源，將在醫(yī)藥和保健食品工業(yè)中擁有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Study on extraction and antioxidant activity of total flavonids from Polygonum chinense

DONG Yan-hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，China）

The ultrasonic extraction process and antioxidant activity of total flavonids from Polygonum chinense were studied.The effects of four factors on extraction rate for total flavonoids were discussed by single factor experiment including material-liquid ratio，ethanol concentration，extraction time and extraction temperature. The orthogonal experiment showed the optimum conditions were as follows：material-liquid ratio 1∶50g/mL，ethanol concentration 50%，extraction temperature 70℃，extraction time 20min.Under these conditions，the extraction rate of total flavonoids was 4.28%.The results of antioxidation showed that the flavonoids from Polygonum chinense had good reduction ability，and also had significant scavenging activity on DPPH·and OH·，the scavenging rates to free radicals were positive proportional to the flavonoids concentration.The EC50of scavenging activity to DPPH·was 0.00519mg/mL.The EC50of scavenging activity to OH·was 0.150mg/mL.

Polygonum chinense；total flavonoids；extraction；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2015）14-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.052

2014－09－15

董艷輝（1981－），女，碩士，實驗師，研究方向：現(xiàn)代分析技術(shù)及應(yīng)用。