木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+（/NH4）2SO4雙水相體系中親和分配行為研究

彭　健，張海德，董安華，許英豪，蔡　濤，王偉濤，劉長玲

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+（/NH4）2SO4雙水相體系中親和分配行為研究

彭健，張海德*，董安華，許英豪，蔡濤，王偉濤，劉長玲

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

目的：研究木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相體系中分配行為。方法：采用濁點(diǎn)法，構(gòu)建雙水相相圖，考察各成相劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響；研究不同PEG4000和（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同PEG-IDA-Fe3+的取代量時(shí)，木瓜蛋白酶在兩相體系中分配行為的變化；用響應(yīng)面法優(yōu)化親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分離條件；同時(shí)對(duì)木瓜蛋白酶在萃取體系中的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果：當(dāng)兩相體系中pH6.9，PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，PEG-IDA-Fe3+為3%時(shí)，木瓜蛋白酶的上相酶活性回收率達(dá)90.5%，蛋白分配系數(shù)達(dá)1.85，而其在PEG/（NH4）2SO4中的酶活回收率及蛋白分配系數(shù)都低于PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相體系。結(jié)論：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO親和雙水相系統(tǒng)能有效提高木瓜蛋白酶的分配效果，采用Fe3+螯合PEG成相劑的雙水相萃取木瓜蛋白酶條件溫和，不影響酶的特征結(jié)構(gòu)。

親和雙水相，PEG-IDA-Fe3+，木瓜蛋白酶，分配行為

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）是由212個(gè)氨基酸殘基組成的一種含巰基（-SH）肽鏈的內(nèi)切酶，有耐高溫、穩(wěn)定性好、蛋白質(zhì)水解能力強(qiáng)等特征，作為一種工業(yè)酶制劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、細(xì)胞分離、食品、清潔劑、皮革紡織和制藥［1］。但粗木瓜蛋白酶制品，即使經(jīng)過分離純化，其純度仍然不高，難以在醫(yī)藥、精細(xì)化工等方面得到廣泛應(yīng)用。因此，對(duì)木瓜蛋白酶分配行為和機(jī)制的研究非常緊迫。雙水相體系（Aqueous twophase system）是指某些親水性的高分子聚合物與聚合物或聚合物與無機(jī)鹽溶解在水中，形成互不相溶的兩相或多相的體系［2］。生物物質(zhì)通過氫鍵、電荷作用、范德華力、疏水力、空間效應(yīng)等與雙水相體系產(chǎn)生相互作用，從而達(dá)到萃取分離的目的。親和雙水相主要有兩種存在形式：一是制備親和成相劑，在成相聚合物中接入具有親和作用的金屬離子或基團(tuán)［3-4］，二是添加游離的親和配基［5-6］。Ling YQ等［7］將親和染料Reactive Red 120添加到PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)游離親和染料Reactive Red 120對(duì)木瓜蛋白酶的分配無明顯影響。HSC Barbosa等［8］，發(fā)現(xiàn)PEGIDA-Cu2+的添加量能有效提高DNA的純化效果；肖進(jìn)新等［9］實(shí)驗(yàn)證明親和配基的引入極大地增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分配的選擇性。

本文擬采用PEG4000制備PEG-IDA-Fe3+，代替PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中的部分PEG，形成親和雙水相，探討木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相中的分配行為，并對(duì)萃取體系中的木瓜蛋白酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，為高純度、高活力木瓜蛋白酶的制取提供理論指導(dǎo)。

表1　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液Table 1　Tyrosine standard solution

1　材料與方法

1.1材料與儀器

聚乙二醇4000（CP）、干酪素（CP）、硫酸銨（AR）、G-250國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶（3500U/mg） 生工生物有限公司；PEG-IDA-Fe3+（螯合率0.6mol/mol）實(shí)驗(yàn)室參照Lin等［10］的方法制備；其他試劑均為市售分析純。

PL303分析天平梅特勒—托利多（上海）有限公司；TU1901紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用有限責(zé)任公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)上海雷磁儀器廠；SHA-2恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1木瓜蛋白酶活性的測定配制100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸原液，按表1所示稀釋，測其在275nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以酪蛋白為底物，測木瓜蛋白酶在10min內(nèi)水解產(chǎn)生的酪氨酸在275nm處吸光值，計(jì)算上相中木瓜蛋白酶的酶活濃度［11］。

1.2.2蛋白含量的測定采用Bradford方法［12］，以牛血清蛋白（BSA）為基準(zhǔn)蛋白。配制100μg/mL蛋白原溶液，按表2稀釋，在595nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液Table 2　Bovine serum albumin standard solution

1.2.3雙水相相圖的制備將PEG4000、PEG-IDAFe3+和（NH4）2SO配成50%的原溶液，準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的PEG4000原溶液于50mL小燒杯中，邊振蕩邊滴加（NH4）2SO4原溶液，至混合液出現(xiàn)混濁，再加入適量的去離子水，使體系變澄清，繼續(xù)加入（NH4）2SO4原溶液，使體系再次變混濁，反復(fù)操作多次，分別記錄每次加入的（NH4）2SO4和去離子水質(zhì)量，計(jì)算體系達(dá)到混濁時(shí)PEG4000和（NH4）2SO4在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，繪制PEG4000/（NH4）2SO4雙節(jié)線圖。

1.2.4親和雙水相萃取木瓜蛋白酶配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液，調(diào)節(jié)至所需pH。根據(jù)不同的雙水相體系，計(jì)算加入PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液的量，加入2mL酶含量為10mg/mL酶溶液，然后加去離子水至20.0g。常溫下振蕩30min后，靜置45min，使分相清晰。測定上下相體積，分取上下相，稀釋后分別測定其酶活性和蛋白含量。計(jì)算上下相蛋白分配系數(shù)Kp和酶活性回收率Y（%）。公式如下：

Kp=上相蛋白濃度/下相度蛋白濃度

Y（%）=上相酶活性濃度×上相體積/加入系統(tǒng)酶活性總量×100

1.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1各雙水相組分對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%的PEG-IDAFe3+，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%的PEG4000和（NH4）2SO4溶液，各取9mL分別加入1mL酶含量為10mg/mL的酶液，渦旋混合后靜置45min。取0.25mL稀釋40倍后，按1.2.1的方法測定木瓜蛋白酶的活性，對(duì)照組中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液用水代替。

酶活比X（%）=成相劑存在時(shí)酶活性/對(duì)照組酶活性×100

1.3.2（NH4）2SO4對(duì)分配行為的影響固定雙水相中PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（NH4）2SO4對(duì)分配行為的影響。

1.3.3PEG4000對(duì)分配行為的影響固定雙水相中（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG4000對(duì)分配行為的影響。

1.3.4PEG-IDA-Fe3+取代量對(duì)分配行為的影響確定雙水相中（NH4）2SO4和PEG4000的最佳萃取條件后，分別用PEG-IDA-Fe3+取代原雙水相中的部分PEG4000，考察不同PEG-IDA-Fe3+的取代量對(duì)分配行為的影響。

1.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)與單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用BBD（Box-behnken Design）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)pH（X1）、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X4）四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，選取酶活性回收率（Y%）和分配系數(shù)（Kp）為考察指標(biāo)，以獲得親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳條件，實(shí)驗(yàn)因素的水平編碼表見表3。

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼表Table 3　List of coded factors and levels for RSM

1.5結(jié)構(gòu)表征

分別取含酶親和雙水相的上相、木瓜蛋白酶液以及不含酶的雙水相上相1mL，稀釋10倍，在260～320nm進(jìn)行光譜掃描。分別取3mg木瓜蛋白酶、PEG4000以及含酶雙水相中上相干燥粉末，與一定量的KBr研磨，用壓片機(jī)壓片后，在400～4000cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行FT-IR光譜檢測。

1.6數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 8.0和Origin 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示：y=0.0073x+0.0006，R2=0.9991，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Tyrosine standard curve

2.2牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示：y=0.0076x+ 0.0178，R2=0.9968，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3PEG-IDA-Fe3+和PEG4000相圖的比較

綜合文獻(xiàn)［3］報(bào)道，選擇10%的PEG被PEG-IDAFe3+取代，繪制雙節(jié)線圖如圖3所示，親和成相劑加入后，上下兩相間的差異變大，相圖不對(duì)稱性增強(qiáng)。這是因?yàn)镻EG螯合金屬離子后，分子上的極性基團(tuán)（羥基）被部分取代，導(dǎo)致PEG分子極性程度減弱，PEG溶液和（NH4）2SO4溶液之間的憎水性差別增大，造成更大的分相推動(dòng)力，導(dǎo)致雙結(jié)點(diǎn)曲線與原相圖曲線有所不同。但是親和成相劑的加入，對(duì)該體系相圖的雙節(jié)點(diǎn)曲線的影響不大，相圖的構(gòu)建，為本研究中雙水相系統(tǒng)成相劑濃度的選擇提供依據(jù)。

圖2　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Bovine serum albumin standard curve

圖3　10%的PEG4000被PEG-IDA-Fe3+取代的PEG/（NH4）2SO4系統(tǒng)相圖Fig.3　Phase diagrams of PEG/（NH4）2SO4with 10%PEG4000 substituted by PEG-IDA-Fe3+

2.4成相劑對(duì)酶活的影響

圖4　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-IDA-Fe3+對(duì)酶活性的影響Fig.4　Effect of concentration of PEG-IDA-Fe3+on the activity of enzyme

圖5　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG4000和硫酸銨對(duì)酶活性的影響Fig.5　Effect of concentration of PEG4000 and（NH4）2SO4on the activity of enzyme

各成相劑對(duì)酶活影響，如圖4和圖5所示，PEGIDA-Fe3+對(duì)木瓜蛋白酶活性產(chǎn)生微弱的抑制作用，當(dāng)其添加量達(dá)到9%時(shí)，酶活比仍在95%以上；PEG4000對(duì)酶活性幾乎沒有影響，高濃度的（NH4）2SO4也會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生一定抑制，這種抑制一般是可逆的。在實(shí)驗(yàn)過程中PEG-IDA-Fe3+添加量不會(huì)超過9%，（NH4）2SO4濃度不會(huì)超過22%，因此由各組分形成的雙水相體系，不會(huì)對(duì)酶的活性造成太大影響。

2.5體系中各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響

2.5.1（NH4）2SO4對(duì)分配行為的影響（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶分配影響，結(jié)果如圖6所示：Y和Kp隨著（NH4）2SO4濃度的增大而迅速增大，在19%～21%存在最大值。說明在雙水相萃取過程中，鹽析作用也是使木瓜蛋白酶趨于上相的重要原因之一；但隨著鹽濃度的增大，一方面對(duì)酶活性產(chǎn)生了一定抑制，另一方面鹽含量的增加也使相比減小，使上相酶含量降低。綜上，選取中間值20%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的零水平。

圖6　（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.6　Effect of（NH4）2SO4concentration on partitioning behavior

2.5.2PEG4000對(duì)分配行為的影響PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶分配的影響結(jié)果如圖7所示：Y和Kp隨著PEG4000濃度的增大而增大，在濃度為19%時(shí)達(dá)到最大而后又隨之減小。這是由于PEG4000的濃度增大，系線長度增加，體系兩相性質(zhì)差別增大，木瓜蛋白酶趨于分配在上相，而濃度繼續(xù)增大則上相粘度增加，酶分子與PEG4000在兩相界面形成一層乳狀膜，使酶向上相轉(zhuǎn)移困難而集中在兩相之間。因后期響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)要加入PEG-IDA-Fe3+，故降低PEG4000的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此選擇16%進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖7　PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.7　Effect of PEG4000 concentration on partitioning behavior

2.5.3PEG-IDA-Fe3+取代量對(duì)分配行為的影響固定雙水相體系PEG4000 19%、（NH4）2SO421%、pH7.0、酶添加量1.0mg/g，用實(shí)驗(yàn)室制備的PEG-IDA-Fe3+取代體系中的PEG4000，考察PEG-IDA-Fe3+的取代量對(duì)分配行為的影響。圖8可以看出，采用PEG-IDA-Fe3+代替部分原雙水相中的PEG4000能有效的提高酶在上相的回收率和蛋白濃度比。當(dāng)體系中PEG-IDAFe3+含量在3%～5%時(shí)有最好效果，其上相回收率可由原來的72.16%提高到80.43%，蛋白分配比由1.58提高到1.68。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中選效果較好的3.5%為PEG-IDA-Fe3+作為零水平。過渡金屬離子與蛋白質(zhì)分子表面氨基酸殘基，會(huì)產(chǎn)生配位結(jié)合、π鍵、靜電力作用，因此添加一定量金屬螯合親和成相劑能有效提高酶的分配效果［13］；但取代量增大時(shí)，酶與金屬離子的親和接近飽和狀態(tài)，并且PEG-IDA-Fe3+的取代量增大，酶活受到一定的影響而導(dǎo)致分配效果下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陸瑾、林東強(qiáng)等［14］利用EOPO/PES/EOPOIDA-Cu2+雙水相體系萃取納豆激酶的結(jié)果相似。

圖8　PEG-IDA-Fe3+取代量對(duì)分配行為的影響Fig.8　Effect of PEG-IDA-Fe3+replacement on partitioning behavior

2.6PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相系統(tǒng)的響應(yīng)面優(yōu)化及結(jié)果分析

對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到兩個(gè)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y（%）=89.92-0.49X1-3.23X2+4.72X3-3.81X4+ 0.86X1X2-4.5X1X3+0.58X1X4-3.46X2X3-14.4X2X4-7.95X3X4-12.07X12-11.88X22-26.54X32-20.68X42式（1）

Kp=1.83-0.015X1-0.082X2+0.097X3-0.14X4+ 0.030X1X2-0.11X1X3+0.007X1X4-0.073X2X3-0.32X2X4-0.21X3X4-0.23X12-0.25X22-0.57X32-0.44X42式（2）

方程（1）和方程（2）的R2為0.95和0.97，說明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值之間相關(guān)度高，模型擬合性良好；校正R2分別為0.91和0.94，表明90%以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。

對(duì)表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。兩個(gè)回歸模型的p值都小于0.01，回歸方程極顯著，擬合的二次回歸方程合適。對(duì)式（1）中Y（%）回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值進(jìn)行比較，得各因子影響從大到小依次為：（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH；式（2）中各因子對(duì)Kp影響大小依次為：PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH。表5的分析結(jié)果表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，X2、X3、X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對(duì)Y（%）和Kp影響顯著；X1X3對(duì)Kp影響顯著而對(duì)Y（%）影響不顯著；X1對(duì)Y（%）和Kp影響都不顯著。這表明pH對(duì)酶在雙水相中的分配行為影響不大，從側(cè)面反映了木瓜蛋白酶有較寬的pH適應(yīng)性。

對(duì)Y（%）和Kp的響應(yīng)面圖進(jìn)行分析結(jié)果見圖9，如圖9（a）和圖9（b）所示：PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG-IDA-Fe3+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活回收率Y（%）的影響均類似拋物線，即隨著PEG4000、（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶活回收率有先增后減的趨勢。由圖9（c）和圖9（d）可知，PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和PEG-IDA-Fe3+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白分配比Kp影響也呈拋物線形，因此在實(shí)際應(yīng)用過程中，應(yīng)控制PEG4000、（NH4）2SO4和PEGIDA-Fe3+的用量。圖9中，Y（%）和Kp的最大值處于各因素條件變化范圍之內(nèi)，表明所選變化范圍合理有效。

表4　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4　Experimental design and result of RSM（Actual）

圖9　Y（%）和Kp的響應(yīng)面Fig.9　3D responsive surface of Y（%）and Kp

在已建立的模型基礎(chǔ)上，設(shè)定優(yōu)化目標(biāo)響應(yīng)值Y（%）和Kp最大，通過Design Expert預(yù)測模型的最優(yōu)條件為：pH=6.9、PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，此時(shí)酶活回收率（Y）和蛋白濃度比（Kp）分別為90.50%和1.85。通過3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到Y(jié)和Kp的實(shí)驗(yàn)值分別為91.25%和1.87，實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值一致性良好，采用響應(yīng)面法對(duì)木瓜蛋白酶在親和雙水相中分配條件的優(yōu)化是有效的。

2.7木瓜蛋白酶在萃取體系中的結(jié)構(gòu)表征

UV-vis光譜如圖10所示，雖然上相介質(zhì)對(duì)木瓜蛋白酶270nm以下的吸收光譜造成了一定的干擾，但木瓜蛋白酶在富集的上相和純水中的最大吸收峰都出現(xiàn)在278nm處，且峰型基本一致，與不含酶的上相介質(zhì)峰型完全不同。表明萃取到上相的木瓜蛋白酶沒有與萃取介質(zhì)反應(yīng)，紫外吸收特征明顯，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

表5　實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5　Variance analysis of test result

圖10　木瓜蛋白酶在不同條件下的UV-vis吸收光譜Fig.10　UV spectra of papain in different conditions

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）作為一種分析分子結(jié)構(gòu)的有效手段，具有所需樣品少、操作簡便、測量速度快、易測定蛋白質(zhì)的瞬間結(jié)構(gòu)等眾多優(yōu)點(diǎn)［15］。蛋白質(zhì)的紅外吸收光譜主要是由一系列酰胺吸收帶組成，其中，酰胺I帶（Amide I 1600～1700cm-1）主要是C=O伸縮振動(dòng)吸收，酰胺II帶（Amide II 1480～1575cm-1）主要是C-N伸縮振動(dòng)吸收，常用于多肽和蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究［16］。從圖11可以看出：萃取前木瓜蛋白酶的Amide I吸收峰在1650cm-1，Amide II吸收峰在1539cm-1；萃取后，在木瓜蛋白酶和親和雙水相上相的混合體系中，木瓜蛋白酶的兩個(gè)吸收峰仍在相同的位置識(shí)別到，并無新的吸收峰形成。說明在親和雙水相中木瓜蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，這與Zhiwen Bai等［17］研究離子液體雙水相萃取蛋白質(zhì)有相同的結(jié)論。由此可見，親和雙水相體系萃取蛋白質(zhì)的條件溫和。

圖11　木瓜蛋白酶、親和雙水相上相、富含木瓜蛋白酶的上相FT-IR吸收光譜Fig11　FT-IR spectra of papain，top phase of ATPS，papain in the top phase of ATPS

3　結(jié)論

木瓜蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4雙水相體系中分配行為的對(duì)比，表明金屬螯合親和雙水相能有效地提高雙水相對(duì)木瓜蛋白酶的萃取效果。響應(yīng)面確定PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳條件：pH6.9、PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、PEGIDA-Fe3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，此時(shí)木瓜蛋白酶上相酶活性回收率（Y）達(dá)90.5%，蛋白分配比（Kp）達(dá)1.85，得到的回歸模型擬合度高，能很好的預(yù)測木瓜蛋白酶在雙水相中的分配行為。對(duì)比體系中木瓜蛋白酶的UV-vis光譜和FT-IR光譜，其特征吸收峰未發(fā)生改變，表明親和雙水相萃取蛋白質(zhì)的條件溫和，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

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Study of affinity partition behavior of papain in PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4aqueous two-phase system

PENG Jian，ZHANG Hai-de*，DONG An-hua，XU Ying-hao，CAI Tao，WANG Wei-tao，LIU Chang-ling
（Department of Food College，Hainan University，Haikou 570228，China）

Objective：To study the partion behavior of papain in affinity aqueous two-phase system（ATPS）which compossed of PEG，PEG-IDA-Fe3+and（NH4）2SO4.Methods：Investigated the phase diagrams of these two type of ATPS.Considered the influence of reagents on papain activity，and the effect of PEG4000 and（NH4）2SO4concentration，replacement rate of PEG-IDA-Fe3+on partition behavior were investigated.Optimization conditions of papain affinity partitioning were annalyzed using response surface methodology，and enzyme conformation before and after extraction was examinated.Results：The recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain were achieved 90.5%and 1.85 respectively under the condition of pH6.9，PEG4000 16%（W/W），ammonium sulfate 20%（W/W），PEG-IDA-Fe3+3%（w/w）.Conclusion：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4system could significantly improve the recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain.The condition of affinity aqueous two-phase system which compossed of PEG-IDA-Fe3+were mild，would not damage the structure features of papain.

affinity aqueous two-phase system；PEG-IDA-Fe3+；papain；partion behavior

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0205-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.034

2014－09－26

彭健（1989-），男，碩士研究生，主要從事食品分離技術(shù)方面的研究。

張海德（1970-），男，博士，教授，主要從事食品分離技術(shù)方面的研究。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31260401）；海南大學(xué)服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（HDSF201306）；海南大學(xué)2014年研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目。