紹興腐乳發酵過程中蛋白質水解及其對成品白點影響的研究

朱洪康，孫軍勇，陸　　健，2，*

（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇宿遷223800）

紹興腐乳發酵過程中蛋白質水解及其對成品白點影響的研究

朱洪康1，孫軍勇1，陸健1，2，*

（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇宿遷223800）

研究了紹興腐乳發酵過程中蛋白質水解與酪氨酸含量變化的規律，分析了不同發酵時間腐乳樣品的氨基酸態氮、三氯乙酸-氮溶指數（TCA-NSI）、游離氨基酸、蛋白質水解度（DH）、酪氨酸含量及蛋白質分子量變化。結果表明：紹興腐乳發酵過程中坯料中酪氨酸隨著氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH的增加而增加；1～40d內主要是7S和11S蛋白質的分解，40d以后主要是小分子蛋白質的進一步分解。相關性分析表明，游離酪氨酸的含量與DH的Pearson相關系數最高。同時對成熟腐乳的研究發現有白點腐乳的TCA-NSI、DH和游離酪氨酸顯著高于無白點腐乳，這表明了腐乳中白點的形成是由蛋白質過度水解造成的。本研究為紹興腐乳白點的控制提供了參考。

腐乳，白點，酪氨酸，蛋白水解

腐乳又稱乳腐、乳豆腐、霉豆腐、豆腐乳、臭豆腐或長毛豆腐，是我國著名的傳統釀造豆制品和調味品之一［1］。它是用大豆蛋白的凝乳狀物，經過接種微生物、加鹽腌制、加酒后酵、成熟包裝等工藝制成的一種干酪型產品，在歐美地區被稱為中國干酪［2］。腐乳作為佐餐食品或調味品，因其滋味鮮美，風味獨特，營養豐富，價格低廉而深受國內外人們的喜愛［3］。而紹興腐乳與國內其他腐乳最為本質的區別在于紹興腐乳配料鹵采用的是具有獨特風味和獨特營養與口感的紹興黃酒，使紹興腐乳產生一種與其他腐乳不同的腐乳濃香［4］。

然而，紹興腐乳在貨架期期間表面產生的白色顆粒或片狀物則會影響腐乳的外觀質量，影響產品的銷售。這些白色顆粒或片狀物大部分附在腐乳表面的菌絲體上，也有的沉積于容器底部，一般稱之為腐乳白點［1］。腐乳生產企業通常采取在標簽上注明“本品表面偶有白點或白片，系氨基酸結晶，食用無妨”。目前對白點的研究集中在白點分析［5］、菌株馴化和酶活控制方面［6-7］。鮑松林［5］分析了腐乳白點的成分，證實其主要成分為酪氨酸（73%～76%）、少量苯丙氨酸和一些菌絲體；何熙［6］、江景泉［7］用酪氨酸對毛霉菌株進行馴化，發現成熟腐乳中酪氨酸含量明顯降低，從而認為可以有效控制白點的產生。

腐乳是豆腐經發酵制成，而已知1kg大豆分離蛋白含有酪氨酸38g［8］。目前對紹興腐乳發酵過程中酪氨酸形成規律的研究還未見報道。何冰芳［9］研究發現豆腐經過毛霉發酵后酪氨酸與苯丙氨酸含量增加7.25倍。本研究通過分析紹興腐乳發酵過程中大豆蛋白的水解程度與酪氨酸含量的變化，研究酪氨酸的形成規律，并且分析有白點和無白點的腐乳蛋白質水解程度的差異，為腐乳白點的控制提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腐乳紹興當地超市；毛霉菌株實驗室保藏菌株Mucor sp.SX11；豆坯江蘇無錫農貿市場，含水量80.59%；黃酒浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，酒精度≥12%vol；食鹽江蘇省鹽業集團有限責任公司；酪氨酸Sigma-Aldrich公司；乙腈為色譜純，購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白質標準品上海生工生物工程公司；其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外-可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；SCINO KT260凱氏定氮儀福斯賽諾分析儀器（蘇州）有限公司；Agilent 1260高效液相色譜美國安捷倫公司；垂直電泳儀美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5415DEppendorf公司；JD-801凝膠成像儀江蘇省捷達科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1紹興腐乳生產工藝參見王瑞芝《中國腐乳釀造》中紹興腐乳生產工藝［1］，具體參數如下：培養基為麩皮10g，水11mL，接種后30℃培養3d，加入200mL無菌水，紗布過濾后用噴壺均勻噴灑到豆坯（24mm× 24mm×14mm）表面，25℃培養2d，腌制時加鹽量為18%，腌至鹽坯食鹽含量≥12%，每14塊坯料加黃酒90mL，室溫發酵。

1.2.2樣品處理取豆坯、毛坯、腌坯、后酵不同時間的腐乳樣品坯料7塊于漏斗上靜置30min，放入潔凈的研缽中研磨成糊狀后凍干備用；稱取1g凍干粉末于100mL燒杯中，加水20mL煮沸，冷卻后定容至100mL，過濾，取濾液待測。

1.2.3氨基酸態氮測定甲醛滴定法［1］。

1.2.4三氯乙酸-氮溶指數（TCA-soluble nitrogen index，TCA-NSI）稱取0.1g樣品粉末，加入0.8mol/L TCA 20mL，振蕩后靜置10min，過濾，取濾液10mL，凱氏定氮法測其中含氮量；另稱取0.1g樣品粉末用凱氏定氮法直接測其含氮量，兩者之比即為三氯乙酸-氮溶指數［10］。

1.2.5氨基酸分析

1.2.5.1游離酪氨酸分析取0.1g樣品粉末，加入5% TCA 5mL，超聲處理30min后雙層濾紙過濾，取濾液1mL 10000r/min離心10min，取清液100μL與100μL硼酸鈉溶液（pH=10.4）混勻后用高效液相色譜法測定酪氨酸含量。采用HYPERSIL ODS（C18，250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，5%的乙腈水溶液為流動相，柱溫40℃，洗脫流速=1.0mL/min，FLD檢測波長：Ex=215nm、Em=283nm［11］。

1.2.5.2游離氨基酸分析上述離心后的上清液，稀釋適當倍數后，取1mL，參照莫蓓紅［12］的方法進行。

1.2.6蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）1.2.2濾液稀釋后取2mL，加入2mL茚三酮顯色劑，沸水浴加熱15min，冷卻后加入5mL 40%乙醇溶液混勻，用50mL容量瓶定容，15min后在570nm下測吸光度，從標準曲線查得腐乳游離-NH2數［13］。

準確稱取0.05g凍干豆腐樣品于水解管中，加入6mol/L的鹽酸10mL，抽真空后用酒精噴燈密封，110℃恒溫器中反應24h，水解完后，把水解管開封，用旋轉蒸發儀去除鹽酸，干涸后用蒸餾水溶解，定容至100mL后過濾；稀釋5倍后取稀釋液2mL按上述方法操作，從標準曲線上查得蛋白強酸水解后的總游離-NH2數。按下式計算：

式中：Nh—不同時間腐乳樣品中的游離-NH2數（μmol）；N0—豆腐蛋白中固有的游離-NH2數（μmol）；NT—蛋白強酸水解后的總游離-NH2數（μmol）。

1.2.7Tricine-SDS-PAGE分析0.1g凍干粉末于2mL離心管，加入15%的TCA-丙酮1mL，振蕩后離心，去掉上清液，重復2次，用丙酮洗滌沉淀3次后將沉淀晾干，加入1mL溶劑（含8mol/L尿素、1%SDS、1%β-巰基乙醇、0.05mol/L Tris），振蕩后離心，取上清液作為電泳樣品，上樣量為10μL；本實驗采用分析小分子肽的N-三（羥甲基）甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE），采用三層不連續膠結構，配制的濃縮膠、夾層膠、分離膠分別為7%、12%、16.5%；陽極緩沖液為Tris 12.11g加水定容至500mL，用6mol/L HCl調至pH=8.90；陰極緩沖液為Tris 6.06g，Tricine 8.96g，SDS 0.5g，加水定容至500mL；先用40V電泳，樣品離開加樣孔后改用70V電泳至結束［14］。凝膠在50%甲醇、10%醋酸溶液中固定30min后以考馬斯亮藍R-250染色1.5h，染色結束后以10%甲醇、10%醋酸脫色至背景清晰，凝膠用JD-801凝膠成像儀記錄。

1.2.8腐乳含氮物質分析對市售無白點腐乳和有白點腐乳按上述實驗方法進行含氮物質含量分析與顯著性分析。

1.3數據分析

數據用SPSS 19.0分析軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1氨基酸態氮與游離酪氨酸含量的變化

由圖1可知，腐乳在后酵過程中，氨基酸態氮隨著腐乳發酵的進行而增加，同時腐乳中游離酪氨酸含量也增加。氨基酸態氮在1～10d內變化不明顯，從第10d開始，氨基酸態氮含量明顯增加，30d以后逐漸下降可能是因為微生物對含氮物質的利用；游離酪氨酸含量在1～60d內緩慢增加，從60d開始，游離酪氨酸從0.13g/100g增加到0.24g/100g，增加79.45%。這可能是因為以蛋白酶為主的毛霉酶系在毛坯、腌坯和發酵初期主要在腐乳表面，蛋白質水解較慢；隨著后酵的進行，蛋白酶滲入豆坯內部，蛋白質降解，釋放出氨基端，使得氨基酸態氮增加，而小分子蛋白質和多肽水解成酪氨酸則較慢。

圖1　腐乳發酵過程中氨基酸態氮與游離酪氨酸變化Fig.1　Changes of the amino nitrogen and free Tyrosine during sufu fermentation

2.2TCA-NSI與游離酪氨酸含量的變化

三氯乙酸能溶解小分子肽類，所以TCA-NSI表示腐乳中小分子肽的含量，從而可以表示蛋白的水解程度。由圖2看出，腐乳經過接種培養、腌制和前期發酵，直到后酵20d，TCA-NSI都是增加的，從20d以后變化趨于平緩，表明此時大分子的豆坯蛋白質在毛霉內肽酶作用下已基本降解成小分子的肽。同時，游離酪氨酸含量緩慢增加，這說明小分子肽在形成的同時也被外肽酶降解形成酪氨酸。

圖2　腐乳發酵過程中TCA-NSI與游離酪氨酸變化Fig.2　Changes of the TCA-NSI and free Tyrosine during sufu fermentation

2.3游離氨基酸與游離酪氨酸含量的變化

由圖3發現，豆坯、毛坯和腌坯時游離氨基酸含量幾乎沒有變化，1～30d內，游離氨基酸含量增加緩慢，而游離酪氨酸含量增幅明顯高于游離氨基酸；30～50d內，游離酪氨酸增幅卻低于游離氨基酸，這可能是由于外肽酶對小分子肽類作用加快，從而形成氨基酸速度加快；50～70d內，游離氨基酸含量趨于穩定，此時游離酪氨酸含量在60～70d增幅加快，這可能是因為此時的小分子肽類更適宜被分解成氨基酸。

圖3　腐乳發酵過程中游離氨基酸與游離酪氨酸變化Fig.3　Changes of free amino acid and free Tyrosine during sufu fermentation

2.4DH與游離酪氨酸含量的變化

水解度表示蛋白質被水解的程度，從圖4可以看出，豆坯從接種培養開始水解，毛坯、腌坯和后酵1d時，蛋白水解度幾乎沒有變化，從1d開始到后酵結束，蛋白水解度逐漸增加，在1～40d內變化最明顯，從1.92%增到5.04%。而游離酪氨酸在毛坯、腌坯和后酵1d時含量變化較小，1d以后隨著蛋白質的水解度增加而緩慢增加，在發酵后10d，游離酪氨酸增幅達79.45%，說明腐乳中酪氨酸的含量是隨著蛋白質的水解而產生的。

圖4　腐乳發酵過程中蛋白水解度與酪氨酸變化Fig.4　Changes of the DH of protein and Tyrosine during sufu fermentation

2.5Tricine-SDS-PAGE分析

大豆貯藏蛋白的主要成分是球蛋白，根據其沉淀特征將其分為2S、7S、11S及15S，分別占總蛋白量的8%、35%、52%及5%，7S組分的分子量在150～180ku，主要是β-伴大豆球蛋白，由α’、α和β 3個亞基構成，其分子量分別為72、68、52ku；11S組分的分子量在360ku左右，主要是大豆球蛋白，由酸性和堿性亞基構成，其分子量分別為38ku和20ku左右［15］。

由圖5可知，豆坯中蛋白質主要為11S組分，其次為7S組分，而7S優先被降解，從毛坯到后酵20d，7S組分逐漸降解；11S組分中發生降解的主要是30～40ku左右的蛋白，蛋白降解后5～25ku分子量的蛋白明顯增加，進入后酵40d時，蛋白質條帶的變化已經不明顯，說明大分子蛋白質的降解已基本結束，此后直到成熟，腐乳中主要是小分子蛋白質或多肽的降解。

圖5　腐乳發酵過程中Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.5　Tricine-SDS-PAGE during sufu fermentation

2.6相關性分析

以游離酪氨酸為縱坐標，分別以氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸和DH為橫坐標做散點圖，利用SPSS19.0進行兩變量間的相關性分析，并且進行線性回歸分析，相關分析結果見表1。

顯著性（雙側）小于0.01時，表示在0.01水平上顯著相關，所以如表1所示，氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸均在0.01水平上具有極顯著相關性；Pearson相關系數越接近于1說明相關度越高，表1中DH-游離酪氨酸的Pearson相關系數最大，且最接近于1，所以DH-游離酪氨酸的相關度最高，線性回歸方程的擬合度最好。因此，成熟腐乳中酪氨酸的過量與大豆蛋白的過度水解有很大關系。

2.7含氮物質對白點影響的分析

對市售無白點腐乳和有白點腐乳坯料中的氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的曲線擬合模型見圖6，顯著性分析結果見表2。

表1　氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸相關性分析參數估計值Table 1　The correlation of parameter between amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine

圖6　氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的曲線擬合模型Fig.6　Curve fitting model between amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine

如表2所示，有白點腐乳中氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH和游離酪氨酸都高于無白點腐乳中的成分。已知當顯著性小于0.05時表示測量值有顯著差異。所以，從表2中發現，有白點腐乳和無白點腐乳的氨基酸態氮、游離氨基酸無顯著差異；而TCA-NSI、DH和游離酪氨酸有顯著差異。由此可以認為，腐乳白點的形成與TCA-NSI、DH和游離酪氨酸有關。而TCANSI、DH都表示蛋白質的水解程度，所以，腐乳白點的產生跟大豆蛋白質的過度水解產生過量酪氨酸有關，這為進一步控制腐乳白點的產生提供了理論參考。

表2　紹興無白點腐乳與有白點腐乳坯料中氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸分析Table 2　The analysis of amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine in Shaoxing sufu phetze without and with white particles

3　結論

作為傳統大豆發酵制品，大豆蛋白中的酪氨酸在腐乳發酵過程中伴隨著蛋白質的水解而游離出來。在紹興腐乳發酵過程中氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH和游離酪氨酸都隨著發酵的進行而增加。通過對腐乳發酵過程中氨基酸態氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的相關性分析以及對成熟無白點腐乳和有白點腐乳中此類含氮物質的分析發現，酪氨酸的產生與蛋白質的水解度相關性最高且有白點腐乳和無白點腐乳中此類含氮物質具有顯著差異性。本研究通過跟蹤紹興腐乳發酵過程中蛋白質的水解和酪氨酸含量的變化以及對成熟腐乳的含氮物質分析，研究酪氨酸形成及其對成熟腐乳白點形成的影響，為進一步控制腐乳白點提供理論參考。

［1］王瑞芝.中國腐乳釀造［M］.北京：中國輕工業出版社，2009：1，157，242，429-431.

［2］彭湘屏，盧紅梅.腐乳研究新進展［J］.中國調味品，2010，35（2）：31-34，45.

［3］江景泉，張惟廣.腐乳的白點問題研究進展［J］.四川食品與發酵，2008，44（1）：24-27.

［4］陳宇.紹興咸亨腐乳的生產與營養保健功能［J］.江蘇調味副食品，2003，20（5）：17-20.

［5］鮑松林，丁霄霖.腐乳白點的成分鑒定［J］.無錫輕工業學院學報，1993，12（4）：270-275.

［6］何熙.腐乳白點問題及電場磁場催熟腐乳的研究［D］.廣州：華南理工大學，2001.

［7］江景泉.毛霉馴化及微波對腐乳白點抑制效果的研究［D］.重慶：西南大學，2009.

［8］曾小波，朱新貴，林志省.高鹽稀態法釀造醬油過程中L-酪氨酸的析出規律［J］.食品與發酵工業，2011，37（9）：90-93.

［9］何冰芳，王淑如，陳瓊華.霉豆腐發酵前后蛋白質氨基酸組成的變化［J］.氨基酸雜志，1986（2）：10-11.

［10］Govindaraj K.Studies on the preparation and characterization of protein hydrolysates from groundnut and soybean isolates［D］. Mysore：University of Mysore，2003.

［11］Allen KR，Degg TJ，Rushwoth PA，Smith M，et al.Measurement of phenylalanine and tyrosine in plasma by high-performance liquid chromatography using the inherent fluorescence of aromatic amino acids［J］.Ann Clin Biochem，1999，36（2）：207-211.

［12］莫蓓紅，趙建，苗君蒞，等.一種植物乳桿菌對干酪模型成熟中微生物及蛋白質水解的影響［J］.食品工業科技，2012，33（7）：100-104.

［13］余勃，陸兆新.微生物發酵法產大豆多肽液水解度的測定［J］.食品科學，2005，26（4）：104-107.

［14］張銳昌，王綺，張應龍，等.Tricine-SDS-PAGE測定小麥蛋白酶解物分子量分布［J］.食品研究與開發，2012，33（12）：168-171.

［15］Miroljub B Barac＇，Slaana P Stanojevic＇，Sne?ana T Jovanovic＇，et al.Soy protein modification-A review［J］.Acta Periodica Tchnologica，2004，2004（35）：3-16.

Study on the hydrolysis of proteins in the process of Shaoxing sufu fermentation and the influence on white particles in products

ZHU Hong-kang1，SUN Jun-yong1，LU Jian1，2，*
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University；The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University；School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，Suqian 223800，China）

The rules of the protein hydrolysis and the tyrosine content were studied.The changes of amino nitrogen，TCA-soluble nitrogen index（TCA-NSI），free amino acid，degree of hydrolysis（DH），tyrosine and protein molecular weight were analyzed.Results showed that tyrosine increased with the increase of amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH in pehtze during Shaoxing sufu fermentation.The mainly degraded proteins in the first 40 days were 7S and 11S proteins，while the mainly degraded substance after 40 days was low molecular protein.Correlation analysis indicated that the Pearson correlation coefficient of the content of free tyrosine and DH was higher than that of others.Besides this，the TCA-NSI，DH and free tyrosine were higher in sufu with white particles than those in sufu without white particles，so it could be concluded that the white particles in sufu were formed due to the excessive hydrolysis of proteins.This research could provide reference to control white particles in Shaoxing sufu.

sufu；white particles；Tyrosine；hydrolysis of proteins

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.028

2014－09－01

朱洪康（1989-），男，碩士研究生，主要從事調味品方面的研究。

陸健（1968-），男，博士，教授，研究方向：啤酒釀造微生物與酶技術、傳統發酵領域微生物資源與酶體系、新型生物制劑（大宗飼料原料的生物技術處理）。

973項目（2012CB720802）；973項目（2013CB733602）；安全食品精深加工科技創新平臺建設（2012B091400030）；高等學校學科創新引智計劃（111計劃）資助項目（111-2-06）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。