薄膜-探頭式超聲法和注乙醇-DHPM法制備的魚油脂質體的理化性質研究

涂宗財，馬　　達，王　　輝，張　　露，沙小梅

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學功能有機小分子教育部重點實驗室，江西南昌330022）

薄膜-探頭式超聲法和注乙醇-DHPM法制備的魚油脂質體的理化性質研究

涂宗財1，2，馬達1，王輝1，張露1，沙小梅1

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.江西師范大學功能有機小分子教育部重點實驗室，江西南昌330022）

通過比較優化后的薄膜-探頭式超聲法（脂質體Ⅰ）和注乙醇-DHPM法（脂質體Ⅱ）制備的魚油脂質體的理化性質及穩定性，初步評價兩種方法的優點與缺點。分別測定脂質體Ⅰ和脂質體Ⅱ的包封率、載量、粒徑分布、Zeta電位以及形態觀察和4、25℃條件下貯藏pH變化、貯藏粒徑變化。結果顯示脂質體Ⅱ相比脂質體Ⅰ的平均粒徑、多分散指數（PDI）、Zeta電位小，TEM、AFM顯示脂質體Ⅱ比脂質體Ⅰ的顆粒完整性更好。4℃和25℃條件下分別貯存35d的對比結果表明脂質體Ⅱ相比于脂質體Ⅰ在儲存過程中的pH、平均粒徑變化小，貯藏穩定性更好。

魚油，薄膜-探頭式超聲，注乙醇-DHPM，納米脂質體

魚油中富含二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）［1］。研究表明：這兩種多不飽和脂肪酸，不但可以有效的防治心血管疾病［2］、缺油癥、炎癥、癌癥、而且能夠調節血脂［3］、增強免疫力、健腦益智［4］以及保護視網膜［5］等，但DHA和EPA為多烯脂肪酸決定了它極易被氧化變質，而且產生難聞的氧化味和對人體健康有害的氧化產物。為了克服魚油的這些缺點，充分利用優質的魚油資源，可將魚油繼續深加工制備成魚油納米脂質體，提高抗氧化性，部分掩蓋其魚腥味［6］。

脂質體（Liposome）或稱類脂小球、液晶微囊，是將藥物包封于類脂質雙分子層形成的薄膜間隙，所制成的超微型球狀載體制劑，常用的制備方法有薄膜法、超聲法、擠壓法、French壓力法、冷凍干燥法、乙醇注入法、乙醚注入法、逆向蒸發法、鈣融合法［7-8］。本實驗室運用改進的注乙醇—DHPM（動態高壓微射流）法［9］制備的魚油納米脂質體其各項性質均較好，為了對本實驗室制備的脂質體進行科學的評價，將自制脂質體同傳統的優化后薄膜—探頭式超聲法［10-11］進行比較，以便為魚油納米脂質體的制備提供更好的思路。本實驗運用薄膜—探頭式超聲法和注乙醇—DHPM法分別制脂質體Ⅰ和脂質體Ⅱ，并對兩種脂質體的包封率和載量、平均粒徑及分布情況、Zeta電位、微觀形態和貯存穩定性進行評價，為魚油納米脂質體的開發與應用提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

魚油（EPA+DHA＞30%）南京森海生物油脂廠；大豆卵磷脂（≥90%） 德國Lipiod公司；膽固醇（A.R） 上海藍季科技發展有限公司；其他試劑均為分析純，北京索萊寶生物科技有限公司。

Microfluidizer Processor M-110EH微射流儀美國Microfluidics公司；NICOMP380/ZLS納米粒度分析儀美國PSS粒度分析儀公司；H-600透射電鏡、U-2910紫外分光光度計日本日立公司；JY98-IIIN超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；AJ-III原子力顯微鏡上海愛建納米科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1魚油納米脂質體的制備薄膜—探頭式超聲法制備魚油納米脂質體：參考文獻［10-11］的基礎上有所修改，將大豆磷脂（20mg/mL）∶魚油膽固醇∶吐溫-80按質量比10∶1∶2加入無水乙醇中，在40℃下攪拌混勻，并超聲（300W）處理90s，將乙醇旋轉蒸發完，在燒瓶壁形成一層薄膜，隨后用磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=7.2）沖洗薄膜得到粗脂質體，將粗脂質體經過超聲處理，即得到魚油納米脂質體。

注乙醇—DHPM法制備魚油納米脂質體［9］。

1.2.2包封率（EE）和載量（DL） 用標準曲線法繪制魚油石油醚溶液的線性回歸方程為A＝1.197X+0.0319，R2＝0.9974。并在274nm處測其包封率和載量［12］。

1.2.3粒徑分布和Zeta電位［13］分別取兩種方法在最佳條件下制備的脂質體，加入蒸餾水稀釋到合適濃度，用Nicomp380/ZLS納米激光粒度分析儀測定粒徑大小和粒度分布，光源波長360nm，散射角90°，樣品平行測三次。然后在Zeta Potential模式下測定Zeta電位，光源波長635nm，電場10V/cm，電流0.2mA。

1.2.4形態考察及穩定性評價

1.2.4.1透射電鏡（Transmission electron micrograph，TEM）、原子力顯微鏡（AFM）觀察運用負染色法對脂質體進行透射電鏡觀察，在放大倍率60000×下觀察，工作電壓為75kV的透射電鏡下觀察魚油納米脂質體的形態。AFM觀察用潔凈云母片快速刮層使樣品形成吸附膜；放置于空氣中自然干燥，取適量的去離子水洗脫未吸附的雜質和樣品，重復兩次，待樣品自然干燥后待測［14-15］。

1.2.4.2穩定性評價將脂質體Ⅰ和脂質體Ⅱ分裝于小瓶中，分別在冷藏（4℃）、常溫（25℃）條件下避光貯存，分別于0、7、14、21、28、35d取樣，按以下指標對穩定性進行評價［16-17］。

a：外觀的變化：評價標準為：－：溶液均一、無絮凝和沉淀；－＋：混懸液有少量絮凝和沉淀；＋：混懸液呈微黃色有少量絮凝和沉淀；＋＋：混懸液呈微黃色、有大量絮凝和沉淀。

b：pH的變化：用精密pH計分別測定兩種脂質體不同貯存天數后的pH。

2　結果與分析

2.1兩種脂質體的理化性質比較

比較采用薄膜—探頭式超聲法制備魚油納米脂質體Ⅰ和注乙醇—DHPM法制備魚油納米脂質體Ⅱ的各項理化性質。表1是測得脂質體Ⅰ和脂質體Ⅱ的理化性質，脂質體Ⅱ相比于Ⅰ脂質體的EE、DL都明顯增大，但平均粒徑和多分散指數（PDI）減小，說明DHPM的高壓作用比探頭式超聲的空穴和風化作用對脂質體顆粒的作用更明顯，可以明顯的降低脂質體的粒徑，同時增大比表面積，使得包封率得到了一定的提升［18］。脂質體Ⅱ相對于脂質體Ⅰ有更小的Zeta電位，磷脂雙分子層聚集在一起時受到更小的靜電力，能夠更好的形成穩定均一的脂質體體系。

2.2脂質體的形態觀察

2.2.1脂質體的TEM圖圖1是兩種脂質體放大60000倍的透射電鏡圖，脂質體Ⅰ和脂質體Ⅱ都呈圓形或不規則橢圓形，且脂質體Ⅱ更加圓滑，顆粒更加飽滿，大小也相對均一，這與粒徑和DPI的結果是一致的。

表1　兩種方法制備的魚油納米脂質體理化性質Table 1　The characteristics and qualities of both fish oill nanoliposomesⅠandⅡwere measured

圖1　Ⅰ和Ⅱ的透射電鏡圖Fig.1　TEM of nanoliposomeⅠandⅡ

2.2.2脂質體的原子力顯微鏡圖圖2是原子力顯微鏡在3μm范圍內觀察到的兩種脂質體的形態，從圖2（ⅠB）中可以明顯的看出脂質體Ⅰ輪廓不太清晰分布也不均勻，這可能由于探頭式超聲設備作用于溶液產生局部熱作用過強導致，相比脂質體Ⅰ而言，脂質體Ⅱ更加均一，完整性更好。

2.3脂質體的穩定性考察結果

2.3.1外觀的變化表2是貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和Ⅱ外觀的影響，從表2可以看出，在4℃條件下貯存，脂質體Ⅰ在第28d開始出現絮凝，脂質體Ⅱ外觀沒有變化；在25℃條件下貯存，脂質體Ⅰ在第7d開始出現沉淀，而脂質體Ⅱ在貯存第21d出現沉淀，總體來說脂質體Ⅱ相比于脂質體Ⅰ更容易保存。

圖2　脂質體Ⅰ和Ⅱ的AFM圖Fig.2　AFM image of nanoliposomeⅠandⅡ

表2　貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和Ⅱ外觀的影響Table 2　The effect of storage temperature and time on the appearance of liposomesⅠandⅡ

2.3.2pH的變化圖3是貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和ⅡpH的影響，由圖3可以看出，4℃貯存條件下脂質體Ⅰ和Ⅱ的pH變化小，基本都在7.2±0.05范圍內，25℃時隨著貯存時間的延長pH顯著降低，且脂質體Ⅰ下降明顯快于脂質體Ⅱ。由于超聲會產生瞬間高溫可能破壞了磷脂的結構，使其穩定性下降，溫度從4℃上升到25℃會使磷脂發生氧化產生溶血卵磷脂和游離脂肪酸等，生成的這些產物不僅會使體系pH降低，還會加速脂質體的氧化和水解［19］。脂質體Ⅱ貯藏穩定性也要明顯好于脂質體Ⅰ。

2.3.3粒徑的變化圖4是貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和Ⅱ粒徑的影響，由圖4可以看出，4℃貯存35d可以看出兩種脂質體的平均粒徑均增大，脂質體Ⅱ平均粒徑由（127.3±7.6）nm增至（163.7±8.2）nm，脂質體Ⅰ由（235±11.9）nm增大（352.5±14.8）nm；25℃貯存35d，兩種脂質體平均粒徑也均在增大，且脂質體Ⅰ的粒徑提高了4倍為（875.1±22.5）nm，已經喪失了納米脂質體的特性［20］；脂質體Ⅱ平均粒徑由（127.3± 7.6）nm增大到（285.9±8.9）nm。綜上所述，脂質體無論是貯存在4℃條件下還是25℃，脂質體Ⅱ相比脂質體Ⅰ有更好的貯藏穩定性。

圖3　貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和ⅡpH的影響Fig.3　The effect of storage temperature and time on the pH of nanoliposomesⅠandⅡ

圖4　貯存溫度和時間對脂質體Ⅰ和Ⅱ粒徑的影響Fig.4　The effect of storage temperature and time on the particle size of nanoliposomesⅠandⅡ

3　結論

本文比較了薄膜分散—超聲法和乙醇注入—DHPM法制備的兩種魚油脂質體的理化性質：脂質體Ⅱ比脂質體Ⅰ的包封率更高，平均粒徑、PDI、Zeta電位小，說明其顆粒聚集在一起時受到分子間作用力更小，更容易聚集形成納米脂質體。TEM、AFM顯示脂質體Ⅱ比脂質體Ⅰ的顆粒更圓滑、更均勻飽滿、完整性更好。4℃和25℃條件下貯存35d的對比表明，貯存過程中脂質體Ⅱ比脂質體Ⅰ的pH、平均粒徑變化小，貯藏穩定性更好。

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Physicochemical properties of fish oil nanoliposomes made by thin-film rehydration-ultrasonic and ethanol injection-DHPM

TU Zong-cai1，2，MA Da1，WANG Hui1，ZHANG Lu1，SHAO Xiao-mei1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule，Ministry of Education，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China）

The merits and disadvantages of thin-film rehydration-ultrasonic method and ethanol injection-DHPM were evaluated by comparing the physicochemical properties of fish oil（FO）nano liposomes prepared under individual optimum conditions.（liposome I and liposome II，respectively）The polydisperse index，particle size，zeta potential，transmission electron microscopy and pH of liposomes was detected.Result：NanoliposomesⅡexhibited small eraverage particle，PDI and zeta potentialsize，than nano liposomes I.TEM and AFM analysis revealed that the particle integrity of liposome II was better than liposomes I.Conclusion：Compared with nanoliposomes I，nanoliposomesⅡ exhibites greater characteristies，and ethanol injection-DHPM could be a potent technique for the preparation of nanoliposomes.

fish oil；thin-film rehydration-ultrasonic method；ethanol injection-DHPM method；nanoliposomes

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0127-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.017

2013－11－11

涂宗財（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物資源開發與高效利用。

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2012CB126314）；江西省重大科技創新研究項目（20124ACB00600）。